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Protokoll
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Spezialpraktikum Genetik
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04.05.09 – 18.05.09
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Christoph Schwörer
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Inhaltsverszeichnis
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Inhalt
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1.
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Einleitung ......................................................................................................................................... 3
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1.2
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1.3
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Allgemein ................................................................................................................................. 3
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Beschreibung der Versuche ..................................................................................................... 3
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1.2.1
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Versuch 1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen.......................................... 3
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1.2.2
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Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .................................................. 3
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1.2.3
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Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen ..................................................... 3
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1.2.4
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Versuch 4: Klonierung ..................................................................................................... 4
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2. Materialien und Methoden ............................................................................................................. 5
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2.1
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Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ..................................................................... 5
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2.1.1
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Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5
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2.2
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Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .......................................................... 5
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2.2.1
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Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5
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2.2.2
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Verwendete Mittel .......................................................................................................... 7
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2.3
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Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ................................................................. 8
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2.3.1
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Versuchsdurchführung .................................................................................................... 8
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2.3.2
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Verwendete Materialien ................................................................................................. 9
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2.4
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Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 10
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2.4.1
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Versuchsdurchführung .................................................................................................. 10
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2.4.2
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Verwendete Materialien ............................................................................................... 10
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3
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Ergebnisse...................................................................................................................................... 12
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3.1
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3.2
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3.3
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3.4
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Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ................................................................... 12
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Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 25
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Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 28
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Klonierung ............................................................................................................................. 34
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4
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Diskussion ...................................................................................................................................... 35
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4.1
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4.2
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4.3
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4.4
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GBP1 Pflanzen KO Typisierung .............................................................................................. 35
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Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 35
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Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 35
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Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 35
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1. Einleitung
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1.2 Allgemein
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Das Thema des Spezialpraktikums Genetik war die Seneszenz bei Pflanzen. Also die
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Alterserscheinungen wie das Absterben alter Blätter und das Bilden von Knospen und
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Früchten. Gesteuert werden diese Prozesse genetisch aber auch in Abhängigkeit von der
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Energiebilanz der Pflanze. Sie sind zudem stark abhängig von Umweltfaktoren wie Hitze,
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Wassermangel etc. Untersuchungen besagen, dass beim einsetzen der Seneszenz auch der
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Spiegel der Radikale, in diesem Fall H2O2 stark ansteigt. Eine der Katalasen welche für den
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Abbau von Radikalen zuständig ist, ist CAT2, welches durch ein Auftreten von GBF1(G-box
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binding factor 1) nach unten reguliert wird. Zudem liegen Informationen vor welche zeigen,
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dass CAT2 in älteren pflanzen stark nach unten reguliert wird. Mit den folgenden Versuchen
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soll nun ein Zusammenhang zwischen der Expression von GBF1 in älteren Pflanzen und
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deren Seneszenzerscheinungen untersucht werden. Hierzu wurden nun 3 Pflanzereihen
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verwendet eine Reihe Col0 Wildtyp Arabidopsis Pflanzen und je eine Reihe Ex und Int
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Planzen bei denen das Gen für GBF1 jeweils im Extron oder Intron ausgeschaltet wurde.
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1.3 Beschreibung der Versuche
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1.2.1 Versuch 1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen
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Dieser Versuch bestand aus 2 Teilen. Zum einen sollten die Pflanzen in ihrem Wachstum
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beobachtet und jede Woche Photografiert werden , zudem sollte ihr Chlorophylgehalt
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bestimmt werden. Zum anderen sollte eine Auswahl der Pflanzen mit Abscicinsäure
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besprüht werden welche die Wirkung von Phytohormen in Pflanzen unterdrückt und einen
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natürlichen Wachstumsinhibitor darstellt. Diese sollten dann wiederum im Vergleich zu den
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Wildtypflanzen in ihrem Wachstum beobachtet werden.
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1.2.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
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Bei diesem Versuch sollten die Protoplasten von transgenen Pcat2:GUS Pflanzen,
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Arabidopsis thaliana, isoliert werden. Diese Protoplasten sollten anschließend zum Einen
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mit einem leeren 35 S Vektor (PY01) und zum Anderen mit einem 35 S:GBF 1 Vektor
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transformiert werden. Da das Reportergen GUS hinter einem CAT2 Promotor bei Zugabe von
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GBF1 reduziert exprimiert wird, wurde bei Verwendung des 35S Vektors auch eine
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Reduktion der GUS Aktivität im Vergleich zur Verwendung des PY01 Vektors erwartet.
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1.2.3 Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen
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Bei diesem Versuch sollten wöchentlich Blattproben der Pflanzen entnommen werden um
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daraus RNA zu
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isolierte RNA sollte dann aufgereinigt und zu cDNA
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umgeschrieben werden. Mit der cDNA sollte dann eine RT-PCR durchgeführt werden. Zur
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Kontrolle wurden hierbei Actin Primer verwendet und für den von GBF1 die vorliegenden
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isolieren. Die
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GBF1 Primer. Erwartet wurde ein Nachweis von GBF1 in den Col0 Pflanzen in den anderen
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beiden Reihen wurde kein GBF1 erwartet.
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1.2.4 Versuch 4: Klonierung
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Bei diesem Versuch sollte das sich in einem Blueskriptvektor befindliche gbf2 Gen in einen
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cf203 GFP-Vektor kloniert werden. Dafür sollte der Vektor mit designten Primern mittels PCR
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amplifiziert und das PCR-Produkt anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt werden.
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Um das Amplifikat aufzureinigen und den Blueskript-Vektor zu entfernen sollte dann eine
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Gelextraktion durchgeführt werden. Anschließend sollte sowohl das Amplifikat, als auch der
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cf203 GFP-Vektor einem Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI
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unterzogen und ligiert werden. Nach der darauffolgenden Transformation in kompetente E.
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coli Bakterien sollte zuerst eine Kolonien-PCR, dann eine Plasmid-Mini-Prep durchgeführt
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werden.
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2. Materialien und Methoden
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2.1
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Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung
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2.1.1 Versuchsdurchführung
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Die Pflanzen wurden sowohl mit einer Digitalkamera als auch mit einem Flachbettscanner
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wöchentlich aufgenommen. Hierbei wurde jeweils die ganze Pflanze wie auch jeweils 3
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junge, mittelalte und alte Blätter der ersten Rosette gescannt. Zudem wurde
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Pflanzenmaterial zur späteren Verwendung eingefroren.
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Anschließend wurde die Chlorophylkonzentration der Pflanzen gemessen. Hierzu wurde
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Pflanzenmaterial in 0,2ml 25mM Kalium Phosphat Puffer (pH 7,0), welcher 2mM EDTA
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enthielt homogenisiert. Danach wurde 0,8 ml Aceton hinzugegeben und für 1h bei
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Raumtemperatur stark geschüttelt. Die Lösung wurde anschließend bei 14000 u/min für 30
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min zentrifugiert. Der Chlorophylgehalt des Überstandes wurde danach im Photometer
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gemessen. Aus der Menge an Pflanzenmaterial und der gemessenen Menge an Chlorophyll
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wurde nun die Chlorophyllkonzentration errechnet.
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Zusätzlich wurden über die komplette Zeit des Praktikums 9 Pflanzen (3 von jeder
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Pflanzenreihe aus Col0 Int und Ex) in Intervallen mit Abscisinsäure besprüht. Gleichzeitig
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wurden 9 Pflanzen zur Kontrolle nicht besprüht unter gleichen Bedingungen gehalten.
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2.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
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2.2.1 Versuchsdurchführung
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Von den Verwendeten Pflanzen wurden beim ersten Versuchsdurchlauf 40 mittelgroße und
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beim 2. Durchlauf 40 große Blätter mit einer Rasierklinge in kleine (ca. 1mm) breite Streifen
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geschnitten zusammen mit 20 ml Enzymlösung auf eine Petrischale gegeben. Beim ersten
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Versuchsdurchlauf wurde nun 1 Stunde verdaut, anschließend Vakuuminfiltriert und
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schließlich 2 weitere Stunden verdaut. Beim zweiten Durchlauf wurde zuerst
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Vakuuminfiltriert und anschließend für 3h verdaut. Die Vakuuminfiltration lief für 20 min bei
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200 mBar. Nun wurde die Lösung mit einem 45µm Filter filtriert und die filtrierte Lösung für
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2 min in einem Falcon Tube bei 2500 u\min zentrifugiert. Der Überstand wurde daraufhin
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abpippetiert und das verbleibende Protoplastenpallet
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in 10ml eiskalter W5 Lösung
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resuspendiert. Die Lösung wurde für 30 min auf Eis gehalten und anschließend abermals für
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2 min bei 2500 u\min abzentrifugiert und in 1,5ml MMg gelöst.
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Zur PEG Transfektion wurden 200µl der gelösten Protoplasten zusammen mit 10µg DNA in
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ein Eppendorf Gefäß umpippetiert und anschließend 220µl PEG Lösung hinzugegeben. Diese
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Lösung wurde anschließend bei 25°C für 30min inkubiert und danach mit 2ml W5 Lösung
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versetzt um den Transfektionsprozess anzuhalten. Danach wurde für 2min bei 100g (1500
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u\min) abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Lösung wurde nun mit 1ml W5
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Puffer versetzt und für 20h im Dunkeln über Nacht inkubiert. Es wurden jeweils 3 Proben mit
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dem PY01 Vektor, 3 mit dem P35S Vektor sowie eine mit dem CF 203 Vektor angefertigt.
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Die inkubierten Lösungen wurden nun für 2 Tests verwendet, ein GUS assay und eine protein
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quantifiaction. Die Vorbereitung war hierfür bei beiden Tests gleich. Die Lösung wurde mit
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10ml fall buffer versetzt und bei 400g für 5min zentrifugiert, der Überstand wurde
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verworfen. Die Protoplasten wurden nun in ein 1.5ml Eppendorfgefäß überführt und
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nochmals bei 10000g für 10 sec zentrifugiert, Der Überstand wurde abermals verworfen. Die
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Protoplasten wurden nun mit 36µl protein extraction buffer und 7µl protease inhibitor
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gelöst und im Eisbad gemörsert. Die Lösung wurde nun bei 14000 u\min für 10 min
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zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt.
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Bei der protein quantification wurde nun 5µl Lösung mit 995µl Bradford 1:5 in einer Küvette
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versetzt und 5min ruhen gelassen. Zudem wurde ein blank mit 995µl Bradford 1:5 und 5µl
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protein extraction buffer / protease inhibitor Gemisch erstellt. Die vorbereiteten Küvetten
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wurden nun im Photometer bei einer Wellenlänge von 595nm gemessen.
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Zur GUS quantification wurden 2 Messreihen erstellt. Bei beiden wurde 90µl assay buffer mit
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10µl Probe versetzt. Anschließend wurde eine Messreihe 60 min bei 37°C inkubiert und
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danach mit 900µl 0,2 M Na2CO3 versetzt um die Reaktion zu stoppen. Die andere Messreihe
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wurde nicht inkubiert. Zudem wurde wiederum ein blank mit 90 µl Assay buffer 10 µl protein
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extraction buffer und 900 µl Na2CO3 erstellt. Von beiden Messreihen und dem blank
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wurden nun 1µl auf eine Microtiterplatte pippetiert und im Plattenphotometer die
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Extinkiton bei 355 nm und die Emission 460 bei nm gemessen.
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2.2.2 Verwendete Mittel
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W5 Lösung (1l):
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154 mM NaCl (8,900g)
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125mM CaCl2 (13,873g)
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5mM KCl (0,372g)
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5mM Glukose (0,990g)
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MMg Lösung (0,5l):
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Essay Buffer:
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10ml GUS puffer
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7 µl Mercaptoethanol
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4mg 4MUG (gelöst in 10 µl DMSO)
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Fall Buffer (500ml):
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0,5M Mannitol (45,5 g)
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15mM MgCl2 • 6H20 (1,524g)
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15mM MgCl2 (3,75 ml 2M NgCl2)
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0,1% MES (0,500g)
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0,5 M Mannitol (46,042g)
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pH 5,8
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autoklaviert
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0,1% MES (0,5g)
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pH 5,8
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sterile filtrate
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Extraction Buffer (10ml):
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PEG/Ca Lösung (100ml):
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50mM Tris pH 7,5 (0,5ml 1M Tris)
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40%PEG 4000 (40g)
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100mM NaCl (1ml 1M NaCl)
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0,4M Mannitol (7,285g)
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0,1% Triton X-100 (10µl Triton 100-X)
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0,1M Ca(NO3)2 • 4H2O (2,361g)
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Protease Inhibitor (7x)
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pH 8-9 mit 1-2 Tropfen KOH
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autoklaviert
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gefroren aufbewahren
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GUS Buffer (500ml):
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2,05g Na2HPO4
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1,27g NaH2PO4
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10ml 0,5M EDTA
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0,5ml Triton X-100
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0,5g N-Lauroylsarcosine Sodium Salz (=0,1%)
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2.3
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Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen
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2.3.1 Versuchsdurchführung
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RNA Aufbereitung: Zur Aufarbeitung der RNA wurde folgendermaßen vorgegangen. Zu Beginn wurde
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das gefrorene Blattmaterial in, mit flüssigem Stickstoff gekühlten, Reibeschalen gemörsert und mit 1ml
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Cell-Lysis-Lösung in ein 2ml Eppendorfgefäß überführt und homogenisiert. Zusätzlich wurden 500 µl
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Protein-DNA-Precipitation Lösung gegeben und nach 10maligem invertieren für 10min ins Eisbad
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gestellt. Schließlich wurden die Proben für 10min im Kühlraum bei 14000 u\min zentrifugiert.
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1ml des Überstandes aurde nun in ein neues 2ml Eppendorfgefäß überführt, mit 1ml 100% Isopropanol
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versetzt und nach mehrmaligem invertieren für 5min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Der
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Überstand wurde verworfen das Eppendorfgefäß auf einem Filterpapier abgetupft. Nun wurde der
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restliche 1ml Überstand der Proben zusammen mit 1ml 100% Isopropanol in das bereits verwendete
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Eppendorfgefäß überführt und wiederum für 5min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Der
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Überstand wurde verworfen, das verbleibende Pellet mit 1ml 70% EtOH mehrmals invertiert und dann
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2min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Das verbleibende EtOH wurde verworfen und das
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zurückbleibende Pellet auf dem Heizblock bei 40°C getrocknet.
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Anschließend wurde die verbleibende DNA verdaut. Um dies zu erreichen wurde das Pellet in 6 µl 10x
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Puffer +MgCL gelöst, mit 4 µl DNaseI versetzt und für 30min bei 37°C auf den Heizblock gelegt. Nun
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wurde 1µl EDTA 25mM hinzugefügt und für 10min bei 65°C auf dem Heizblock denaturiert.
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Abschließend wurde jeweils 1µl der Lösung auf dem NanoDrop Gerät gemessen um die RNA
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Konzentration zu bestimmen und die Proben auf Ein Gel aufgetragen um zu prüfen in welchen Proben
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die gewünschte RNA zu finden war. Als positivkontrolle und marker wurde hierbei jeweils der Lamda
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DNA/Hind III Marker, 2 verwendet.
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cDNA Umwandlung: Um nun die RNA in cDNA umzuwandeln wurde ein iScript Reaction Mix verwendet.
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Hierbei wurden 4µl 5x iScript Reaction Mix, 1µl reverser Transcriptase und eine Menge X (wobei X
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=1µg/RNA Konzentration der entprechenden Probe) zusammengebracht und mit autoklaviertem auf
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20µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Proben wurden nun für jeweils 5min bei 25°C, 30min bei 42°C und
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5min bei 85°C auf dem Heizblock erhitzt.
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Semi-quantitative RT PCR: zur Amplifikation der cDNA wurde die DNA 1:10 verdünnt. Anschließend
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wurden jeweils 2 Versuchsreihen durchgeführt. Jeweils eine mit Actin und eine mit GBF1 Primern.
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Hierzu wurde jeweils ein MM (s.u.) angesetzt wobei die jeweiligen primer verwendet wurden. Wichtig
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hierbei war, um eine Gleichverteilung der DNA zu gewärhleisten, dass der MM bis auf die Primer jeweils
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für die Actin und die GBF1 Probe gemeinsam angesetzt wurde dann halbiert und mit den
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entsprechenden Primern versetzt. Die Proben wurden dann durch das PCR Programm laufen gelassen
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bei 60°C Annealingtemperatur für 30sec und 72°C Elongationstemperatur für 30sec für insgesamt 25
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Zyklen.
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Gelelektrophorese: Abschließend wurde jeweils 5µl Probe mit 0,5µl Pufferlösung versetzt und auf ein
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Agarosegel aufgetragen. An dieses wurde 30min eine Spannung von 100Volt angelegt.
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2.3.2 Verwendete Materialien
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MasterMix [MM] (10µl)
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1 µl 10xPuffer (high specific)
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0,4 µl DNTPs (10mM)
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0,1 µl Control TAQ (incl. Polymerase)
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0,5 µl verdünnte cDNA (bei Durchlauf 2 wurden 5µl verwendet)
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1 µl Primer Forward
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1 µl Primer Backward
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5,9 µl H2O (Bei Durchlauf 2 wurden 1,4 µl verwendet)
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Agarosegel:
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30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen
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1µl Ethidiumbromid (1%)
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Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml)
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2.4
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Versuch 4: Klonierung
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2.4.1 Versuchsdurchführung
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Am Anfang wurde die vorhandene GBF2 Sequenz durch eine PCR amplifiziert. Hierbei wurde der 50µl
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Ansatz(siehe 2.4.2) in folgendem PCR Programm eingesetzt: 2 min bei 95°C, 30 sec bei 95°C, 30 sec
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Annealing, 1 min Elongation bei 72°C und 7min bei 72°C.
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Die DNA wurde nun in 10µl H2O gefällt und zusammen mit 1µl loading buffer für 30 min bei 100V auf
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ein Agarosegel aufgetragen. Anschließend wurde das gewünschte Fragment mit dem QIAquick Gel
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Extraction Kit Protokoll aus dem Gel geschnitten. Nun wurde zum einen der cf203 Vector und das
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Template in einem 100µl Ansatz für 3h bei 37°C verdaut und anschließend die Ligation des Vectors und
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des geschnittenen Templates in einem 10µl Ansatz üernacht bei 4°C durchgeführt.
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Zur Transformation wurden nun zuerst 50µl kompetente Zellen und 5µl Ligation für 20 min auf Eis
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gestellt. Um die Zellen aufnahmefähig für Plasmide zu machen wurden sie 1 Minute 42 C ausgesetzt
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(Hitzeschock). Nun wurden 250µl LB Medium hinzugegeben und für 1h schüttelnd bei 37°C inkubiert.
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Anschließend wurde die gesamte Probe auf einer LBSpec Platte ausplattiert und über Nacht bei 37°C
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inkubiert.
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Insgesamt wurden je Platte 16 Kolonien kepickt und in je 7µl H2O in einem PCR Tube gelöst. Zusätzlich
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wurden die Pippettenspitzen nach jedem Lösten auf einer frischen LBSpec Platte ausgestrichen. Die
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gelösten Proben wurden nun zusammen mit einem Mastermix in ein PCR Gerät gegeben.
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2.4.2 Verwendete Materialien
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Agarosegel:
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30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen
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1µl Ethidiumbromid
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Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml)
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50µl Ansatz:
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5µl 10X Puffer
|
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0,5µl LA Taq (proofreading)
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2µl Template
|
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2µl dNTP
|
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2,5µl Primer Forward
|
||
2,5µl Primer Reverse
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35,5µl H2O
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100µl Ansatz:
|
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50µl Gelextrakt
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10µl 10x Tango/KpnI Puffer
|
||
5µl KpnI
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5µl BamHI
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30µl H20
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10µl Ansatz:
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||
1µl 10x Puffer
|
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1µl Ligase
|
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1µl verdauter Vektor
|
||
7µl Gelextrakt
|
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Mastermix:
|
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0,1µl Polymerase
|
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1 µl 10 x Puffer
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0,4 µl dNTPs
|
||
0,7 µl Primer Forward
|
||
0,7 µl Primer Reverse
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3 Ergebnisse
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3.1 Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung
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Col0 4W von oben
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Col0 4W von unten
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Ex 4w von oben
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Ex 4W von unten
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Int 4W von oben
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Int 4W von unten
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Col0 5W von oben
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Col0 5w von unten
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Ex 5W von oben
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Ex 5W von unten
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Int 5W von oben
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Int 5W von unten
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Col0 6W von oben
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Col0 6W von unten
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Col0 6W einzelne Blätter von oben
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Col0 6W einzelne Blätter von unten
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Ex 6W von oben
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Ex 6W von unten
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Ex 6W einzelne Blätter von oben
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Ex 6W einzelne Blätter von unten
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Int 6W von oben
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Int 6W von unten
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Int 6W einzelne Blätter von oben
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||
Int 6W einzelne Blätter von oben
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Col0 7W von oben
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Col0 7W von unten
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Col0 7W von oben
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Ex 7W von oben
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||
Ex 7W von unten
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Ex 7W einzelne Blätter von oben
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Int 7W von oben
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Int 7W von unten
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||
Int 7W einzelne Blätter von oben
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||
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||
Oben Abgebildet sind die Bilder der Pflanzen über den Wachstumzeitraum von Woche 4 bis 7. Es sind
|
||
jeweils 2 Bilder von je 3 Pflanzen der Reichen Col0, Int und Ex. Die Blattmenge und die Zunahme
|
||
derBlattmenge über den betrachteten Zeitraum ist bei allen 3 Reihen gleich stark. Achtet man nun auf
|
||
Seneszenzerscheinungen wie z.B. braune und abgestorbene Blätter und Vergleicht die verschiednen
|
||
Reihen untereinander so fällt auf, dass alle 3 Versuchreihen die gleichen Erscheinungen in gleichem
|
||
Ausmaß zeigen oder nicht zeigen. Nachfolgend abgebildet sind nun die Ergebnisse der Messung des
|
||
Chlorophylgehaltes der einzelnen Reihen in der 6. Woche.
|
||
|
||
Col0 6W
|
||
|
||
Chlorophylgehalt
|
||
|
||
Gew. in g
|
||
|
||
Pflanze 1
|
||
|
||
Pflanze 2
|
||
|
||
Pflanze 3
|
||
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
|
||
0,01
|
||
0,06
|
||
0,08
|
||
0,01
|
||
0,06
|
||
0,1
|
||
0,04
|
||
0,01
|
||
0,07
|
||
|
||
c (mg/l)= (D x
|
||
1000)/34,5
|
||
|
||
(0,1/Gew)*c
|
||
|
||
62,087
|
||
59,739
|
||
21,507
|
||
31,536
|
||
42,609
|
||
50,319
|
||
76,493
|
||
26,145
|
||
26,493
|
||
|
||
620,870
|
||
99,565
|
||
26,884
|
||
315,362
|
||
71,014
|
||
50,319
|
||
191,232
|
||
261,449
|
||
37,847
|
||
|
||
D652
|
||
2,142
|
||
2,061
|
||
0,742
|
||
1,088
|
||
1,47
|
||
1,736
|
||
2,639
|
||
0,902
|
||
0,914
|
||
|
||
Mittelwert:
|
||
Standartab
|
||
|
||
Jung
|
||
375,821
|
||
221,108
|
||
|
||
Mittel
|
||
144,010
|
||
102,703
|
||
|
||
Alt
|
||
38,350
|
||
11,725
|
||
|
||
INT 6W
|
||
|
||
Chlorophylgehalt
|
||
|
||
c (mg/l)= (D
|
||
|
||
Pflanze 1
|
||
|
||
Pflanze 2
|
||
|
||
Pflanze 3
|
||
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
|
||
Gewicht in g
|
||
0,02
|
||
0,1
|
||
0,01
|
||
0,02
|
||
0,1
|
||
0,1
|
||
0,02
|
||
0,04
|
||
0,03
|
||
|
||
D
|
||
1,988
|
||
2,028
|
||
1,278
|
||
2,011
|
||
1,47
|
||
2,56
|
||
1,64
|
||
1,655
|
||
0,902
|
||
|
||
(0,1/Gew)*c
|
||
288,116
|
||
58,783
|
||
370,435
|
||
291,449
|
||
42,609
|
||
74,203
|
||
237,681
|
||
119,928
|
||
87,150
|
||
|
||
57,623
|
||
58,783
|
||
37,043
|
||
58,290
|
||
42,609
|
||
74,203
|
||
47,536
|
||
47,971
|
||
26,145
|
||
|
||
Jung
|
||
|
||
Mittel
|
||
|
||
Alt
|
||
|
||
Mittelwert:
|
||
Standartabw
|
||
|
||
272,415
|
||
30,127
|
||
|
||
73,773
|
||
40,781
|
||
|
||
177,262
|
||
167,417
|
||
|
||
Seite 21
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
Ex 6W
|
||
|
||
Chlorophylgehalt
|
||
|
||
Pflanze 1
|
||
|
||
Pflanze 2
|
||
|
||
Pflanze 3
|
||
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
Jung
|
||
Mittel
|
||
Alt
|
||
|
||
Gewicht in g
|
||
0,01
|
||
0,01
|
||
0,03
|
||
0,02
|
||
0,06
|
||
0,08
|
||
0,02
|
||
0,03
|
||
0,08
|
||
|
||
c (mg/l)= (D
|
||
x
|
||
|
||
D
|
||
|
||
(0,1/Gew)*c
|
||
|
||
1,088
|
||
1,655
|
||
0,781
|
||
0,781
|
||
1,351
|
||
1,693
|
||
1,278
|
||
1,736
|
||
|
||
31,536
|
||
47,971
|
||
22,638
|
||
22,638
|
||
39,159
|
||
49,072
|
||
37,043
|
||
50,319
|
||
|
||
315,362
|
||
159,903
|
||
113,188
|
||
37,729
|
||
48,949
|
||
245,362
|
||
123,478
|
||
62,899
|
||
|
||
Jung
|
||
|
||
Mittel
|
||
|
||
Alt
|
||
|
||
Mittelwert:
|
||
Standartabw
|
||
|
||
179,275
|
||
93,461
|
||
|
||
158,857
|
||
142,157
|
||
|
||
90,584
|
||
60,436
|
||
|
||
Col0 6W
|
||
|
||
INT 6W
|
||
|
||
Ex 6W
|
||
|
||
700,000
|
||
|
||
600,000
|
||
|
||
500,000
|
||
|
||
400,000
|
||
|
||
300,000
|
||
|
||
200,000
|
||
|
||
100,000
|
||
|
||
0,000
|
||
|
||
Jung
|
||
|
||
Mittel
|
||
|
||
Alt
|
||
|
||
Chlorophylkonzentration nach Alter und Reihe mit Standartabweichung
|
||
|
||
Betrachtet man den Chlorophyllgehalt und dessen Abnahme nach Alter der Blätter so lässt sich sagen,
|
||
dass die Abnahme in der Col0 Reihe stärker ausfällt. Dies lässt auf einen funktionierenden GBF1
|
||
Knockout schließen Knockout da hierbei das Chlorophyll in älteren Blättern nicht so schnell abgebaut
|
||
wird wie in Wildtyppflanzen.
|
||
|
||
Die 2te Chlorophyll Messung lässt sich aufgrund fehlender Gewichtsmessungen des Blattmaterials nicht
|
||
auswerten
|
||
|
||
Seite 22
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
400,000
|
||
|
||
350,000
|
||
|
||
300,000
|
||
|
||
250,000
|
||
|
||
200,000
|
||
|
||
150,000
|
||
|
||
100,000
|
||
|
||
50,000
|
||
|
||
0,000
|
||
|
||
Jung
|
||
|
||
Mittel
|
||
|
||
Alt
|
||
|
||
Regressionsgerade der Chlorophylkonzentration
|
||
|
||
Col0 6W
|
||
|
||
INT 6W
|
||
|
||
Ex 6W
|
||
|
||
Col0 6W
|
||
|
||
INT 6W
|
||
|
||
Ex 6W
|
||
|
||
Seite 23
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 05.05.2009
|
||
|
||
Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 18.05.2009
|
||
|
||
Man erkennt deutlich die Wachstumsinhibitorische Wirkung der Abscisinsäure. Die behandelten
|
||
Bplanzen weisen ein deutlich geringeres Wachstum auf als die Unbehandelten. Im Vergleich der 3
|
||
Pflanzenreihen zeigt sich die Wirkung auf die Col0 Pflanzen am deutlichsten.
|
||
|
||
Seite 24
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
3.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
|
||
|
||
Abbildung der Isolierten Protoplasten. Man deutlich erkennen, dass hierbei genügend funktionelle
|
||
Protoplasten isoliert wurden.
|
||
|
||
Ergebnisse der Bradford Messung
|
||
|
||
Seite 25
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
35S
|
||
577425
|
||
500170
|
||
|
||
35S
|
||
680432
|
||
563390
|
||
Ergebnisse des Gus Essay
|
||
|
||
35S
|
||
61627
|
||
60455
|
||
|
||
Py01
|
||
616945
|
||
616249
|
||
|
||
Py02
|
||
619922
|
||
584727
|
||
|
||
Py03
|
||
612286
|
||
555998
|
||
|
||
Blank
|
||
558312
|
||
|
||
Zur Berechnung der spezifischen GUS Aktivität wurde folgende Formel verwendet:
|
||
|
||
AGUS (nmol/mg x min) = (KMU (nM) x VKü (ml) x VF x UF (1l/1000ml)) / (PM (mg) x t (min)
|
||
|
||
Wobei:
|
||
|
||
AGUS
|
||
KMU
|
||
VKü
|
||
VF
|
||
UF
|
||
PM
|
||
T
|
||
|
||
spezifische GUS-Aktivität
|
||
gemessene MU Konzentration
|
||
Volumen in Küvette
|
||
Verdünnungsfaktor
|
||
Umrechnungsfaktor
|
||
Proteinmenge im Ansatz
|
||
Reaktionszeit
|
||
|
||
nmol/(mg x min)
|
||
nM
|
||
|
||
ml
|
||
|
||
1l / 1000ml
|
||
mg
|
||
|
||
min
|
||
|
||
Welche mit eingesetzten Werten zu folgendem Ergebnis führt:
|
||
|
||
35 S
|
||
35 S
|
||
35 S
|
||
|
||
PYO1
|
||
PYO1
|
||
PYO1
|
||
|
||
KMU
|
||
77255
|
||
117042
|
||
11717
|
||
|
||
696
|
||
35195
|
||
56288
|
||
|
||
V KÜ VF
|
||
0,2 100
|
||
0,2 100
|
||
0,2 100
|
||
|
||
UF
|
||
|
||
PM
|
||
0,001 0,29814
|
||
0,001 0,28109
|
||
0,001 0,35108
|
||
|
||
0,2 100
|
||
0,2 100
|
||
0,2 100
|
||
|
||
0,001 0,24083
|
||
0,001 0,29908
|
||
0,001 0,17595
|
||
|
||
T
|
||
60
|
||
60
|
||
60
|
||
|
||
60
|
||
60
|
||
60
|
||
|
||
AGUS
|
||
86,37441
|
||
138,7954
|
||
11,12472
|
||
|
||
0,9633351
|
||
39,225848
|
||
106,63636
|
||
|
||
Mittelwert
|
||
|
||
35 S
|
||
PYO1
|
||
|
||
78,764845
|
||
48,941846
|
||
|
||
Standard
|
||
abweichung
|
||
52,398346
|
||
43,684454
|
||
|
||
Seite 26
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
|
||
i
|
||
|
||
)
|
||
n
|
||
m
|
||
*
|
||
g
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||
m
|
||
(
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/
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l
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o
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||
m
|
||
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90
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||
|
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80
|
||
|
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70
|
||
|
||
60
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||
|
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50
|
||
|
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40
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||
|
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30
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||
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20
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10
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0
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PYO1
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35 S
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Die Annahme, dass das, hinter einen CAT2 Promoter geschaltete, Reportergen GUS bei Zugabe von GBF1
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redzuiert exprimiert wird, konnte mit den vorliegenden Ergebnissen leider nicht bestätigt werden. In
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den hier abgebildeten Ergebnissen ist sogar gegenteiliges der Fall. Hier wurde GUS bei denjenigen
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Protoplasten die einen leeren Vektor ohne GFB1 Gen enthielten weniger stark exprimiert als bei
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denjenigen mit vorhandenem GBF1 Gen.
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3.3 Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen
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Oben abgebildet sind alle im Verlauf des Versuchs produzierten Gelbilder. Die mit „RNA“ beschrifteten
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Bilder sind jeweils die Kontrollen zum prüfen ob verwendbare RNA vorhanden war. Die mit X markierten
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Proben wurden hierbei jeweils für verwendbar befunden zur Umwandlung in cDNA weiter verendet. In
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manchen Fällen erkennt man hierbei die zwei obersten Banden welche die vorhandene 18S und 25S
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RNA darstellen. Die immer sichbaren starken dunklen Banden ganz unten bilden jeweils die defekte
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degradierte RNA. Die mit cDNA markierten Bilder sind die jeweils nach der RT PCR aufgetragenen
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Proben. Die verwendeten Primer sind hierbei auf dem Bild vermerkt. Die untersten Banden stellen auf
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diesen Bildern die komplementären Primer dar die sich aneinander gelagert haben und keine Expression
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darstellen. Falls darüber eine zweite Bande zu sehen ist so stellt dies eine jeweilige positive Expression
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der dem Primer entsprechenden cDNA dar. Einzig der Fall der verwendeten Probe „Col 5C“ auf Bild B5
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stellt sich als unerklärbar dar da hier eine GBF1 Bande aber keine Actin Bande zu sehen ist, welche aber
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zu sehen sein sollte. Das Ergebnis wird daher nicht als positiv bewertet. Die einzige positive Bewertung
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für eine GBF1 Expression stellt die Probe Int 8W von Bild B9 dar, da hier eine Actin Expression sowie eine
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sehr geringe GBF1 Expression zu sehen ist. Dies dürfte aber aufgrund des Knockouts in den Int Pflanzen
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nicht der Fall sein.
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Eine Zusammenstellung der Auswertung der Bilder und der gemessenen RNA-Konzentration und
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Reinheit findet sich in folgender Tabelle:
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Probe
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RNA Isoliert
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RNA
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Konzentration
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Reinheit
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(260/280)
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Actin
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GBF1
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Col0 4W
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Col0 5W
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Col0 6W
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Col0 7W
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Int 4W
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Int 5W
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Int 6W
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Int 7W
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Int 8Wa
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Int 8Wb
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Ex 4W
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Ex 5W
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Ex 6W
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Ex 7W
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positiv
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0,256
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n.v.
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positiv
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||
positiv
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
positiv
|
||
|
||
0,66
|
||
873,2
|
||
0,066
|
||
0,66
|
||
210,4
|
||
122,7
|
||
|
||
0,66
|
||
0,07
|
||
230,4
|
||
0,91
|
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|
||
n.v.
|
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2,1 positiv
|
||
|
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n.v. positiv
|
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1,76 positiv
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1,94
|
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|
||
n.v. positiv
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2,01
|
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|
||
2,1 positiv
|
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1,95 positiv
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|
||
positiv
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3.4 Klonierung
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Man erkennt deutlich, dass keine einzelnen Banden erkennbar sind und die Kolonie PCR somit in diesem
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Fall fehlgeschlagen ist.
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Abgebildet sind die Ergebnisse der PCR auf die Miniprep. Auch hier sieht man an den fehlenden Banden
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bei Verwendung der Control TAQ, dass die Klonierung nicht funktioniert hat, die PCR als solche aber sehr
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wohl wie man an den deutlich sichtbaren Banden bei verwendung der LA-TAQ sieht.
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4 Diskussion
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4.1 GBP1 Pflanzen KO Typisierung
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Da sowohl Pflanzenwachstum als auch Seneszenzerscheinungen in allen 3 Pflanzereihen gleich war
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lassen sich leider keine Aussagen treffen. Möglicherweise treten hier die erwarteten Effekte aber auch
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erst in späteren Wochen auf. Die erhaltenen Ergebnisse entsprachen beim Chlorophylgehalt als auch
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beim Pflanzenwachstum der mit Aba besprühten Pflanzen jedoch den Erwartungen. Die Ergebnisse der
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zweiten Chlorophylmessung waren leider aufgrund fehlender Messungen nicht auswertbar.
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4.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
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Die Ergebnisse in diesem Versuch konnten die Erwartungen leider nicht erfüllen. So waren die meisten
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Messungen aufgrund von Fehlern nicht auswertbar obwohl die isolierten Protoplasten gut aussahen. Es
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wird vermutet dass bei den letzten Messungen Pippetierfehler aufgetreten sind oder Gefäße und
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Beschriftungen vertausc ht wurden. Dies kann aber nicht bestätigt werden.
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4.3 Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen
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Auch dieser Versuch konnte die Erwartungen nicht erfüllen und die Theoretischen Ergebnisse nicht bestätigen. Zu
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einem großen Teil wird das auf die Minderwertige RNA nach Isolierung zurückzuführen sein. Hier wurden
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eventuell prozedurale Fehler gemacht wie z.B. ein zeitweises auftauen des Blattmaterial führte. Dies wiederum
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erzeugte Stress für Pflanzen und führte womöglich zu einer Ausschüttung von Nukleasen. Zudem zeigen die
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Ergebnisse ein Vorhandensein des GBF1 Gens in den KO Pflanzen was wiederum an den Ergebnissen zweifeln
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lässt, da dies
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4.4 Versuch 4: Klonierung
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Dieser Versuch ist fehlgeschlagen. Zum einen waren die verwendeten LBSpec Platten zeitweise nicht
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auffindbar und zum anderen evtl auch zu alt da nicht wie erwartet einzelne Resistente Kolonien
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gewachsen sind sondern ein ganzer Rasen. Zudem können Fehler bei der Plasmidisolierung aufgetreten
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sein, was das totale Fehlen der Plasmide bei der Miniprep erklären würde-
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