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Protokoll des Versuchs Gaschromatographie
Reaktionskinetik
Versuchsdurchführung
Vor dem Versuch wurde vom Betreuer die Referenzlösung bestehend aus
2650 µl Puffer, 100 µl Semicarbazid-HCl, 200 µl NAD und 10 µl GSH
in die Referenzküvette pipettiert und der Nullabgleich des Spektrometers durchgeführt.
Wir führten 11 Enzymtests durch.
Zunächst wurden 2500 µl Puffer, 100 µl Semicarbazid-HCl, 200 µl NAD, 10 µl GSH und 100 µl Ethanol-Testlösung gemischt und im Spektrometer temperiert. Danach wurde die entsprechende Menge Ethanol hinzugegeben — im ersten Versuch 0 µl und in den weiteren Versuchen jeweils 10 µl mehr. Das Gemisch wurde dann 240 s lang im Spektrometer gemessen.
Auswertung 1
| Ethanol [µl] | n [µmol] | Vges [ml] | cs [mmol/l] | 1/cs [l/mmol] |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0,00 | 2,96 | 0,00 | ∞ |
| 10 | 173,28 | 2,96 | 58,54 | 0,0171 |
| 20 | 346,56 | 2,96 | 117,08 | 0,0085 |
| 30 | 519,84 | 2,96 | 175,62 | 0,0057 |
| 40 | 693,12 | 2,96 | 234,16 | 0,0043 |
| 50 | 866,40 | 2,96 | 292,70 | 0,0034 |
| 60 | 1039,68 | 2,96 | 351,24 | 0,0028 |
| 70 | 1212,96 | 2,96 | 409,78 | 0,0024 |
| 80 | 1386,24 | 2,96 | 468,32 | 0,0021 |
| 90 | 1559,52 | 2,96 | 526,86 | 0,0019 |
| 100 | 1732,80 | 2,96 | 585,40 | 0,0017 |
Tabelle 1: Messprotokoll I
| Ethanol [µl] | ΔE/Δt (min⁻¹) | v₀ (µmol l⁻¹ min⁻¹) | 1/v₀ (l min µmol⁻¹) | v₀/cs (10⁻³ min⁻¹) |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0,0084 | 0,00026 | 3846,15 | ∞ |
| 10 | 0,0101 | 0,00034 | 1515,15 | 0,000002 |
| 20 | 0,1926 | 0,00554 | 180,50 | 0,000019 |
| 30 | 0,4092 | 0,01148 | 87,10 | 0,000027 |
| 40 | 0,4385 | 0,01196 | 83,61 | 0,000022 |
| 50 | 0,6109 | 0,01683 | 59,41 | 0,000024 |
| 60 | 0,6084 | 0,01665 | 60,06 | 0,000020 |
| 70 | 0,6593 | 0,01817 | 55,03 | 0,000018 |
| 80 | 0,6354 | 0,01738 | 57,53 | 0,000016 |
| 90 | 0,7997 | 0,02272 | 44,01 | 0,000017 |
| 100 | 0,8794 | 0,02440 | 40,98 | 0,000017 |
Tabelle 2: Messprotokoll II (ΔE/Δt durch lineare Regression bestimmt)
Auswertung 2 – Lineweaver-Burk
- Steigung: m = 0,00000965 × 10⁻³ min⁻¹
- Achsenabschnitt: b = 0,00288 µmol/l
- KM = 0,0033 mmol/l
- v₀,max = 347,22 l min/µmol
Auswertung 3 – Eadie-Hofstee
- Steigung: m = −861,76 × 10⁻³ min⁻¹
- Achsenabschnitt: b = 0,37 µmol l⁻¹ min⁻¹
- KM = 861,76 mmol l⁻¹
- v₀,max = b
Auswertung 4 – Michaelis-Menten
- KM = 0,015
- v₀,max = 0,03
Die Michaelis-Menten-Auftragung ist sehr einfach, da die maximale Geschwindigkeit und die Konstante direkt aus der Formel abgelesen werden können. Diese Methode ist genauer und erfordert kaum Rechenzeit.
Bei Lineweaver-Burk und Eadie-Hofstee werden die Werte mithilfe von Ausgleichsgeraden bestimmt. Da die Geraden unterschiedlich (linear oder logarithmisch) aufgetragen werden können, ergeben sich abweichende Werte. Zudem können durch ungenaues Ablesen Rundungsfehler entstehen.
Auswertung 5 – Temperaturabhängigkeit
Die Geschwindigkeitskonstante k hängt exponentiell von der Umgebungstemperatur T ab:
[ k = k_0 , e^{-\frac{E_A}{RT}} ]
Diese Konstante beeinflusst die Michaelis-Menten-Gleichung, welche wiederum die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt. Eine Temperaturänderung führt also zu einer Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit.
Damit die Temperatur während des Versuchs konstant bleibt, wird die Lösung vor Beginn temperiert. So hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch von der Änderung der Stoffmenge ab.