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Protokoll
Spezialpraktikum Genetik
04.05.09 – 18.05.09
Christoph Schwörer
Inhaltsverszeichnis
Inhalt 1.
Einleitung ......................................................................................................................................... 3
1.2
1.3
Allgemein ................................................................................................................................. 3
Beschreibung der Versuche ..................................................................................................... 3
1.2.1
Versuch 1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen.......................................... 3
1.2.2
Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .................................................. 3
1.2.3
Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen ..................................................... 3
1.2.4
Versuch 4: Klonierung ..................................................................................................... 4
- Materialien und Methoden ............................................................................................................. 5
2.1
Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ..................................................................... 5
2.1.1
Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5
2.2
Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .......................................................... 5
2.2.1
Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5
2.2.2
Verwendete Mittel .......................................................................................................... 7
2.3
Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ................................................................. 8
2.3.1
Versuchsdurchführung .................................................................................................... 8
2.3.2
Verwendete Materialien ................................................................................................. 9
2.4
Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 10
2.4.1
Versuchsdurchführung .................................................................................................. 10
2.4.2
Verwendete Materialien ............................................................................................... 10
3
Ergebnisse...................................................................................................................................... 12
3.1
3.2
3.3
3.4
Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ................................................................... 12
Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 25
Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 28
Klonierung ............................................................................................................................. 34
4
Diskussion ...................................................................................................................................... 35
4.1
4.2
4.3
4.4
GBP1 Pflanzen KO Typisierung .............................................................................................. 35
Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 35
Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 35
Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 35
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1. Einleitung
1.2 Allgemein Das Thema des Spezialpraktikums Genetik war die Seneszenz bei Pflanzen. Also die Alterserscheinungen wie das Absterben alter Blätter und das Bilden von Knospen und Früchten. Gesteuert werden diese Prozesse genetisch aber auch in Abhängigkeit von der Energiebilanz der Pflanze. Sie sind zudem stark abhängig von Umweltfaktoren wie Hitze, Wassermangel etc. Untersuchungen besagen, dass beim einsetzen der Seneszenz auch der Spiegel der Radikale, in diesem Fall H2O2 stark ansteigt. Eine der Katalasen welche für den Abbau von Radikalen zuständig ist, ist CAT2, welches durch ein Auftreten von GBF1(G-box binding factor 1) nach unten reguliert wird. Zudem liegen Informationen vor welche zeigen, dass CAT2 in älteren pflanzen stark nach unten reguliert wird. Mit den folgenden Versuchen soll nun ein Zusammenhang zwischen der Expression von GBF1 in älteren Pflanzen und deren Seneszenzerscheinungen untersucht werden. Hierzu wurden nun 3 Pflanzereihen verwendet eine Reihe Col0 Wildtyp Arabidopsis Pflanzen und je eine Reihe Ex und Int Planzen bei denen das Gen für GBF1 jeweils im Extron oder Intron ausgeschaltet wurde.
1.3 Beschreibung der Versuche
1.2.1 Versuch 1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen Dieser Versuch bestand aus 2 Teilen. Zum einen sollten die Pflanzen in ihrem Wachstum beobachtet und jede Woche Photografiert werden , zudem sollte ihr Chlorophylgehalt bestimmt werden. Zum anderen sollte eine Auswahl der Pflanzen mit Abscicinsäure besprüht werden welche die Wirkung von Phytohormen in Pflanzen unterdrückt und einen natürlichen Wachstumsinhibitor darstellt. Diese sollten dann wiederum im Vergleich zu den Wildtypflanzen in ihrem Wachstum beobachtet werden.
1.2.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen Bei diesem Versuch sollten die Protoplasten von transgenen Pcat2:GUS Pflanzen, Arabidopsis thaliana, isoliert werden. Diese Protoplasten sollten anschließend zum Einen mit einem leeren 35 S Vektor (PY01) und zum Anderen mit einem 35 S:GBF 1 Vektor transformiert werden. Da das Reportergen GUS hinter einem CAT2 Promotor bei Zugabe von GBF1 reduziert exprimiert wird, wurde bei Verwendung des 35S Vektors auch eine Reduktion der GUS Aktivität im Vergleich zur Verwendung des PY01 Vektors erwartet.
1.2.3 Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen Bei diesem Versuch sollten wöchentlich Blattproben der Pflanzen entnommen werden um daraus RNA zu isolierte RNA sollte dann aufgereinigt und zu cDNA umgeschrieben werden. Mit der cDNA sollte dann eine RT-PCR durchgeführt werden. Zur Kontrolle wurden hierbei Actin Primer verwendet und für den von GBF1 die vorliegenden
isolieren. Die
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GBF1 Primer. Erwartet wurde ein Nachweis von GBF1 in den Col0 Pflanzen in den anderen beiden Reihen wurde kein GBF1 erwartet.
1.2.4 Versuch 4: Klonierung Bei diesem Versuch sollte das sich in einem Blueskriptvektor befindliche gbf2 Gen in einen cf203 GFP-Vektor kloniert werden. Dafür sollte der Vektor mit designten Primern mittels PCR amplifiziert und das PCR-Produkt anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt werden. Um das Amplifikat aufzureinigen und den Blueskript-Vektor zu entfernen sollte dann eine Gelextraktion durchgeführt werden. Anschließend sollte sowohl das Amplifikat, als auch der cf203 GFP-Vektor einem Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI unterzogen und ligiert werden. Nach der darauffolgenden Transformation in kompetente E. coli Bakterien sollte zuerst eine Kolonien-PCR, dann eine Plasmid-Mini-Prep durchgeführt werden.
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2. Materialien und Methoden
2.1
Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung
2.1.1 Versuchsdurchführung
Die Pflanzen wurden sowohl mit einer Digitalkamera als auch mit einem Flachbettscanner wöchentlich aufgenommen. Hierbei wurde jeweils die ganze Pflanze wie auch jeweils 3 junge, mittelalte und alte Blätter der ersten Rosette gescannt. Zudem wurde Pflanzenmaterial zur späteren Verwendung eingefroren.
Anschließend wurde die Chlorophylkonzentration der Pflanzen gemessen. Hierzu wurde Pflanzenmaterial in 0,2ml 25mM Kalium Phosphat Puffer (pH 7,0), welcher 2mM EDTA enthielt homogenisiert. Danach wurde 0,8 ml Aceton hinzugegeben und für 1h bei Raumtemperatur stark geschüttelt. Die Lösung wurde anschließend bei 14000 u/min für 30 min zentrifugiert. Der Chlorophylgehalt des Überstandes wurde danach im Photometer gemessen. Aus der Menge an Pflanzenmaterial und der gemessenen Menge an Chlorophyll wurde nun die Chlorophyllkonzentration errechnet.
Zusätzlich wurden über die komplette Zeit des Praktikums 9 Pflanzen (3 von jeder Pflanzenreihe aus Col0 Int und Ex) in Intervallen mit Abscisinsäure besprüht. Gleichzeitig wurden 9 Pflanzen zur Kontrolle nicht besprüht unter gleichen Bedingungen gehalten.
2.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
2.2.1 Versuchsdurchführung Von den Verwendeten Pflanzen wurden beim ersten Versuchsdurchlauf 40 mittelgroße und beim 2. Durchlauf 40 große Blätter mit einer Rasierklinge in kleine (ca. 1mm) breite Streifen geschnitten zusammen mit 20 ml Enzymlösung auf eine Petrischale gegeben. Beim ersten Versuchsdurchlauf wurde nun 1 Stunde verdaut, anschließend Vakuuminfiltriert und schließlich 2 weitere Stunden verdaut. Beim zweiten Durchlauf wurde zuerst Vakuuminfiltriert und anschließend für 3h verdaut. Die Vakuuminfiltration lief für 20 min bei 200 mBar. Nun wurde die Lösung mit einem 45µm Filter filtriert und die filtrierte Lösung für 2 min in einem Falcon Tube bei 2500 u\min zentrifugiert. Der Überstand wurde daraufhin abpippetiert und das verbleibende Protoplastenpallet in 10ml eiskalter W5 Lösung resuspendiert. Die Lösung wurde für 30 min auf Eis gehalten und anschließend abermals für 2 min bei 2500 u\min abzentrifugiert und in 1,5ml MMg gelöst.
Zur PEG Transfektion wurden 200µl der gelösten Protoplasten zusammen mit 10µg DNA in ein Eppendorf Gefäß umpippetiert und anschließend 220µl PEG Lösung hinzugegeben. Diese Lösung wurde anschließend bei 25°C für 30min inkubiert und danach mit 2ml W5 Lösung versetzt um den Transfektionsprozess anzuhalten. Danach wurde für 2min bei 100g (1500 u\min) abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Lösung wurde nun mit 1ml W5
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Puffer versetzt und für 20h im Dunkeln über Nacht inkubiert. Es wurden jeweils 3 Proben mit dem PY01 Vektor, 3 mit dem P35S Vektor sowie eine mit dem CF 203 Vektor angefertigt.
Die inkubierten Lösungen wurden nun für 2 Tests verwendet, ein GUS assay und eine protein quantifiaction. Die Vorbereitung war hierfür bei beiden Tests gleich. Die Lösung wurde mit 10ml fall buffer versetzt und bei 400g für 5min zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen. Die Protoplasten wurden nun in ein 1.5ml Eppendorfgefäß überführt und nochmals bei 10000g für 10 sec zentrifugiert, Der Überstand wurde abermals verworfen. Die Protoplasten wurden nun mit 36µl protein extraction buffer und 7µl protease inhibitor gelöst und im Eisbad gemörsert. Die Lösung wurde nun bei 14000 u\min für 10 min zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt.
Bei der protein quantification wurde nun 5µl Lösung mit 995µl Bradford 1:5 in einer Küvette versetzt und 5min ruhen gelassen. Zudem wurde ein blank mit 995µl Bradford 1:5 und 5µl protein extraction buffer / protease inhibitor Gemisch erstellt. Die vorbereiteten Küvetten wurden nun im Photometer bei einer Wellenlänge von 595nm gemessen.
Zur GUS quantification wurden 2 Messreihen erstellt. Bei beiden wurde 90µl assay buffer mit 10µl Probe versetzt. Anschließend wurde eine Messreihe 60 min bei 37°C inkubiert und danach mit 900µl 0,2 M Na2CO3 versetzt um die Reaktion zu stoppen. Die andere Messreihe wurde nicht inkubiert. Zudem wurde wiederum ein blank mit 90 µl Assay buffer 10 µl protein extraction buffer und 900 µl Na2CO3 erstellt. Von beiden Messreihen und dem blank wurden nun 1µl auf eine Microtiterplatte pippetiert und im Plattenphotometer die Extinkiton bei 355 nm und die Emission 460 bei nm gemessen.
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2.2.2 Verwendete Mittel W5 Lösung (1l):
154 mM NaCl (8,900g)
125mM CaCl2 (13,873g)
5mM KCl (0,372g)
5mM Glukose (0,990g)
MMg Lösung (0,5l):
Essay Buffer:
10ml GUS puffer
7 µl Mercaptoethanol
4mg 4MUG (gelöst in 10 µl DMSO)
Fall Buffer (500ml):
0,5M Mannitol (45,5 g)
15mM MgCl2 • 6H20 (1,524g)
15mM MgCl2 (3,75 ml 2M NgCl2)
0,1% MES (0,500g)
0,5 M Mannitol (46,042g)
pH 5,8
autoklaviert
0,1% MES (0,5g)
pH 5,8
sterile filtrate
Extraction Buffer (10ml):
PEG/Ca Lösung (100ml):
50mM Tris pH 7,5 (0,5ml 1M Tris)
40%PEG 4000 (40g)
100mM NaCl (1ml 1M NaCl)
0,4M Mannitol (7,285g)
0,1% Triton X-100 (10µl Triton 100-X)
0,1M Ca(NO3)2 • 4H2O (2,361g)
Protease Inhibitor (7x)
pH 8-9 mit 1-2 Tropfen KOH
autoklaviert
gefroren aufbewahren
GUS Buffer (500ml):
2,05g Na2HPO4
1,27g NaH2PO4
10ml 0,5M EDTA
0,5ml Triton X-100
0,5g N-Lauroylsarcosine Sodium Salz (=0,1%)
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2.3
Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen
2.3.1 Versuchsdurchführung
RNA Aufbereitung: Zur Aufarbeitung der RNA wurde folgendermaßen vorgegangen. Zu Beginn wurde das gefrorene Blattmaterial in, mit flüssigem Stickstoff gekühlten, Reibeschalen gemörsert und mit 1ml Cell-Lysis-Lösung in ein 2ml Eppendorfgefäß überführt und homogenisiert. Zusätzlich wurden 500 µl Protein-DNA-Precipitation Lösung gegeben und nach 10maligem invertieren für 10min ins Eisbad gestellt. Schließlich wurden die Proben für 10min im Kühlraum bei 14000 u\min zentrifugiert.
1ml des Überstandes aurde nun in ein neues 2ml Eppendorfgefäß überführt, mit 1ml 100% Isopropanol versetzt und nach mehrmaligem invertieren für 5min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen das Eppendorfgefäß auf einem Filterpapier abgetupft. Nun wurde der restliche 1ml Überstand der Proben zusammen mit 1ml 100% Isopropanol in das bereits verwendete Eppendorfgefäß überführt und wiederum für 5min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das verbleibende Pellet mit 1ml 70% EtOH mehrmals invertiert und dann 2min bei max u\min im Kühlraum zentrifugiert. Das verbleibende EtOH wurde verworfen und das zurückbleibende Pellet auf dem Heizblock bei 40°C getrocknet.
Anschließend wurde die verbleibende DNA verdaut. Um dies zu erreichen wurde das Pellet in 6 µl 10x Puffer +MgCL gelöst, mit 4 µl DNaseI versetzt und für 30min bei 37°C auf den Heizblock gelegt. Nun wurde 1µl EDTA 25mM hinzugefügt und für 10min bei 65°C auf dem Heizblock denaturiert. Abschließend wurde jeweils 1µl der Lösung auf dem NanoDrop Gerät gemessen um die RNA Konzentration zu bestimmen und die Proben auf Ein Gel aufgetragen um zu prüfen in welchen Proben die gewünschte RNA zu finden war. Als positivkontrolle und marker wurde hierbei jeweils der Lamda DNA/Hind III Marker, 2 verwendet.
cDNA Umwandlung: Um nun die RNA in cDNA umzuwandeln wurde ein iScript Reaction Mix verwendet. Hierbei wurden 4µl 5x iScript Reaction Mix, 1µl reverser Transcriptase und eine Menge X (wobei X =1µg/RNA Konzentration der entprechenden Probe) zusammengebracht und mit autoklaviertem auf 20µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Proben wurden nun für jeweils 5min bei 25°C, 30min bei 42°C und 5min bei 85°C auf dem Heizblock erhitzt.
Semi-quantitative RT PCR: zur Amplifikation der cDNA wurde die DNA 1:10 verdünnt. Anschließend wurden jeweils 2 Versuchsreihen durchgeführt. Jeweils eine mit Actin und eine mit GBF1 Primern. Hierzu wurde jeweils ein MM (s.u.) angesetzt wobei die jeweiligen primer verwendet wurden. Wichtig hierbei war, um eine Gleichverteilung der DNA zu gewärhleisten, dass der MM bis auf die Primer jeweils für die Actin und die GBF1 Probe gemeinsam angesetzt wurde dann halbiert und mit den entsprechenden Primern versetzt. Die Proben wurden dann durch das PCR Programm laufen gelassen bei 60°C Annealingtemperatur für 30sec und 72°C Elongationstemperatur für 30sec für insgesamt 25 Zyklen.
Gelelektrophorese: Abschließend wurde jeweils 5µl Probe mit 0,5µl Pufferlösung versetzt und auf ein Agarosegel aufgetragen. An dieses wurde 30min eine Spannung von 100Volt angelegt.
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2.3.2 Verwendete Materialien MasterMix [MM] (10µl)
1 µl 10xPuffer (high specific)
0,4 µl DNTPs (10mM)
0,1 µl Control TAQ (incl. Polymerase)
0,5 µl verdünnte cDNA (bei Durchlauf 2 wurden 5µl verwendet)
1 µl Primer Forward
1 µl Primer Backward
5,9 µl H2O (Bei Durchlauf 2 wurden 1,4 µl verwendet)
Agarosegel:
30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen
1µl Ethidiumbromid (1%)
Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml)
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2.4
Versuch 4: Klonierung
2.4.1 Versuchsdurchführung
Am Anfang wurde die vorhandene GBF2 Sequenz durch eine PCR amplifiziert. Hierbei wurde der 50µl Ansatz(siehe 2.4.2) in folgendem PCR Programm eingesetzt: 2 min bei 95°C, 30 sec bei 95°C, 30 sec Annealing, 1 min Elongation bei 72°C und 7min bei 72°C.
Die DNA wurde nun in 10µl H2O gefällt und zusammen mit 1µl loading buffer für 30 min bei 100V auf ein Agarosegel aufgetragen. Anschließend wurde das gewünschte Fragment mit dem QIAquick Gel Extraction Kit Protokoll aus dem Gel geschnitten. Nun wurde zum einen der cf203 Vector und das Template in einem 100µl Ansatz für 3h bei 37°C verdaut und anschließend die Ligation des Vectors und des geschnittenen Templates in einem 10µl Ansatz üernacht bei 4°C durchgeführt.
Zur Transformation wurden nun zuerst 50µl kompetente Zellen und 5µl Ligation für 20 min auf Eis gestellt. Um die Zellen aufnahmefähig für Plasmide zu machen wurden sie 1 Minute 42 C ausgesetzt (Hitzeschock). Nun wurden 250µl LB Medium hinzugegeben und für 1h schüttelnd bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die gesamte Probe auf einer LBSpec Platte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Insgesamt wurden je Platte 16 Kolonien kepickt und in je 7µl H2O in einem PCR Tube gelöst. Zusätzlich wurden die Pippettenspitzen nach jedem Lösten auf einer frischen LBSpec Platte ausgestrichen. Die gelösten Proben wurden nun zusammen mit einem Mastermix in ein PCR Gerät gegeben.
2.4.2 Verwendete Materialien Agarosegel:
30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen 1µl Ethidiumbromid Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml)
50µl Ansatz:
5µl 10X Puffer 0,5µl LA Taq (proofreading) 2µl Template 2µl dNTP 2,5µl Primer Forward 2,5µl Primer Reverse 35,5µl H2O
100µl Ansatz:
50µl Gelextrakt 10µl 10x Tango/KpnI Puffer 5µl KpnI 5µl BamHI
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30µl H20
10µl Ansatz:
1µl 10x Puffer 1µl Ligase 1µl verdauter Vektor 7µl Gelextrakt
Mastermix:
0,1µl Polymerase 1 µl 10 x Puffer 0,4 µl dNTPs 0,7 µl Primer Forward 0,7 µl Primer Reverse
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3 Ergebnisse
3.1 Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung
Col0 4W von oben
Col0 4W von unten
Ex 4w von oben
Ex 4W von unten
Seite 12
Int 4W von oben
Int 4W von unten
Col0 5W von oben
Col0 5w von unten
Seite 13
Ex 5W von oben
Ex 5W von unten
Int 5W von oben
Int 5W von unten
Seite 14
Col0 6W von oben
Col0 6W von unten
Col0 6W einzelne Blätter von oben
Col0 6W einzelne Blätter von unten
Seite 15
Ex 6W von oben
Ex 6W von unten
Ex 6W einzelne Blätter von oben
Ex 6W einzelne Blätter von unten
Seite 16
Int 6W von oben
Int 6W von unten
Int 6W einzelne Blätter von oben
Int 6W einzelne Blätter von oben
Seite 17
Col0 7W von oben
Col0 7W von unten
Col0 7W von oben
Seite 18
Ex 7W von oben
Ex 7W von unten
Ex 7W einzelne Blätter von oben
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Int 7W von oben
Int 7W von unten
Int 7W einzelne Blätter von oben
Seite 20
Oben Abgebildet sind die Bilder der Pflanzen über den Wachstumzeitraum von Woche 4 bis 7. Es sind jeweils 2 Bilder von je 3 Pflanzen der Reichen Col0, Int und Ex. Die Blattmenge und die Zunahme derBlattmenge über den betrachteten Zeitraum ist bei allen 3 Reihen gleich stark. Achtet man nun auf Seneszenzerscheinungen wie z.B. braune und abgestorbene Blätter und Vergleicht die verschiednen Reihen untereinander so fällt auf, dass alle 3 Versuchreihen die gleichen Erscheinungen in gleichem Ausmaß zeigen oder nicht zeigen. Nachfolgend abgebildet sind nun die Ergebnisse der Messung des Chlorophylgehaltes der einzelnen Reihen in der 6. Woche.
Col0 6W
Chlorophylgehalt
Gew. in g
Pflanze 1
Pflanze 2
Pflanze 3
Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt
0,01 0,06 0,08 0,01 0,06 0,1 0,04 0,01 0,07
c (mg/l)= (D x 1000)/34,5
(0,1/Gew)*c
62,087 59,739 21,507 31,536 42,609 50,319 76,493 26,145 26,493
620,870 99,565 26,884 315,362 71,014 50,319 191,232 261,449 37,847
D652 2,142 2,061 0,742 1,088 1,47 1,736 2,639 0,902 0,914
Mittelwert: Standartab
Jung 375,821 221,108
Mittel 144,010 102,703
Alt 38,350 11,725
INT 6W
Chlorophylgehalt
c (mg/l)= (D
Pflanze 1
Pflanze 2
Pflanze 3
Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt
Gewicht in g 0,02 0,1 0,01 0,02 0,1 0,1 0,02 0,04 0,03
D 1,988 2,028 1,278 2,011 1,47 2,56 1,64 1,655 0,902
(0,1/Gew)*c 288,116 58,783 370,435 291,449 42,609 74,203 237,681 119,928 87,150
57,623 58,783 37,043 58,290 42,609 74,203 47,536 47,971 26,145
Jung
Mittel
Alt
Mittelwert: Standartabw
272,415 30,127
73,773 40,781
177,262 167,417
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Ex 6W
Chlorophylgehalt
Pflanze 1
Pflanze 2
Pflanze 3
Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt Jung Mittel Alt
Gewicht in g 0,01 0,01 0,03 0,02 0,06 0,08 0,02 0,03 0,08
c (mg/l)= (D x
D
(0,1/Gew)*c
1,088 1,655 0,781 0,781 1,351 1,693 1,278 1,736
31,536 47,971 22,638 22,638 39,159 49,072 37,043 50,319
315,362 159,903 113,188 37,729 48,949 245,362 123,478 62,899
Jung
Mittel
Alt
Mittelwert: Standartabw
179,275 93,461
158,857 142,157
90,584 60,436
Col0 6W
INT 6W
Ex 6W
700,000
600,000
500,000
400,000
300,000
200,000
100,000
0,000
Jung
Mittel
Alt
Chlorophylkonzentration nach Alter und Reihe mit Standartabweichung
Betrachtet man den Chlorophyllgehalt und dessen Abnahme nach Alter der Blätter so lässt sich sagen, dass die Abnahme in der Col0 Reihe stärker ausfällt. Dies lässt auf einen funktionierenden GBF1 Knockout schließen Knockout da hierbei das Chlorophyll in älteren Blättern nicht so schnell abgebaut wird wie in Wildtyppflanzen.
Die 2te Chlorophyll Messung lässt sich aufgrund fehlender Gewichtsmessungen des Blattmaterials nicht auswerten
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400,000
350,000
300,000
250,000
200,000
150,000
100,000
50,000
0,000
Jung
Mittel
Alt
Regressionsgerade der Chlorophylkonzentration
Col0 6W
INT 6W
Ex 6W
Col0 6W
INT 6W
Ex 6W
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Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 05.05.2009
Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 18.05.2009
Man erkennt deutlich die Wachstumsinhibitorische Wirkung der Abscisinsäure. Die behandelten Bplanzen weisen ein deutlich geringeres Wachstum auf als die Unbehandelten. Im Vergleich der 3 Pflanzenreihen zeigt sich die Wirkung auf die Col0 Pflanzen am deutlichsten.
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3.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen
Abbildung der Isolierten Protoplasten. Man deutlich erkennen, dass hierbei genügend funktionelle Protoplasten isoliert wurden.
Ergebnisse der Bradford Messung
Seite 25
35S 577425 500170
35S 680432 563390 Ergebnisse des Gus Essay
35S 61627 60455
Py01 616945 616249
Py02 619922 584727
Py03 612286 555998
Blank 558312
Zur Berechnung der spezifischen GUS Aktivität wurde folgende Formel verwendet:
AGUS (nmol/mg x min) = (KMU (nM) x VKü (ml) x VF x UF (1l/1000ml)) / (PM (mg) x t (min)
Wobei:
AGUS
KMU
VKü
VF
UF
PM
T
spezifische GUS-Aktivität gemessene MU Konzentration Volumen in Küvette Verdünnungsfaktor Umrechnungsfaktor Proteinmenge im Ansatz Reaktionszeit
nmol/(mg x min) nM
ml
1l / 1000ml mg
min
Welche mit eingesetzten Werten zu folgendem Ergebnis führt:
35 S 35 S 35 S
PYO1 PYO1 PYO1
KMU 77255 117042 11717
696 35195 56288
V KÜ VF 0,2 100 0,2 100 0,2 100
UF
PM 0,001 0,29814 0,001 0,28109 0,001 0,35108
0,2 100 0,2 100 0,2 100
0,001 0,24083 0,001 0,29908 0,001 0,17595
T 60 60 60
60 60 60
AGUS 86,37441 138,7954 11,12472
0,9633351 39,225848 106,63636
Mittelwert
35 S PYO1
78,764845 48,941846
Standard abweichung 52,398346 43,684454
Seite 26
i
) n m * g m ( / l o m
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PYO1
35 S
Die Annahme, dass das, hinter einen CAT2 Promoter geschaltete, Reportergen GUS bei Zugabe von GBF1 redzuiert exprimiert wird, konnte mit den vorliegenden Ergebnissen leider nicht bestätigt werden. In den hier abgebildeten Ergebnissen ist sogar gegenteiliges der Fall. Hier wurde GUS bei denjenigen Protoplasten die einen leeren Vektor ohne GFB1 Gen enthielten weniger stark exprimiert als bei denjenigen mit vorhandenem GBF1 Gen.
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3.3 Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen
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Oben abgebildet sind alle im Verlauf des Versuchs produzierten Gelbilder. Die mit „RNA“ beschrifteten Bilder sind jeweils die Kontrollen zum prüfen ob verwendbare RNA vorhanden war. Die mit X markierten Proben wurden hierbei jeweils für verwendbar befunden zur Umwandlung in cDNA weiter verendet. In manchen Fällen erkennt man hierbei die zwei obersten Banden welche die vorhandene 18S und 25S RNA darstellen. Die immer sichbaren starken dunklen Banden ganz unten bilden jeweils die defekte degradierte RNA. Die mit cDNA markierten Bilder sind die jeweils nach der RT PCR aufgetragenen Proben. Die verwendeten Primer sind hierbei auf dem Bild vermerkt. Die untersten Banden stellen auf diesen Bildern die komplementären Primer dar die sich aneinander gelagert haben und keine Expression darstellen. Falls darüber eine zweite Bande zu sehen ist so stellt dies eine jeweilige positive Expression der dem Primer entsprechenden cDNA dar. Einzig der Fall der verwendeten Probe „Col 5C“ auf Bild B5 stellt sich als unerklärbar dar da hier eine GBF1 Bande aber keine Actin Bande zu sehen ist, welche aber zu sehen sein sollte. Das Ergebnis wird daher nicht als positiv bewertet. Die einzige positive Bewertung für eine GBF1 Expression stellt die Probe Int 8W von Bild B9 dar, da hier eine Actin Expression sowie eine sehr geringe GBF1 Expression zu sehen ist. Dies dürfte aber aufgrund des Knockouts in den Int Pflanzen nicht der Fall sein.
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Eine Zusammenstellung der Auswertung der Bilder und der gemessenen RNA-Konzentration und Reinheit findet sich in folgender Tabelle:
Probe
RNA Isoliert
RNA Konzentration
Reinheit (260/280)
Actin
GBF1
Col0 4W Col0 5W Col0 6W Col0 7W
Int 4W Int 5W Int 6W Int 7W Int 8Wa Int 8Wb
Ex 4W Ex 5W Ex 6W Ex 7W
positiv
0,256
n.v.
positiv positiv positiv positiv positiv positiv
positiv positiv positiv positiv
0,66 873,2 0,066 0,66 210,4 122,7
0,66 0,07 230,4 0,91
n.v. 2,1 positiv
n.v. positiv 1,76 positiv 1,94
n.v. positiv 2,01
2,1 positiv 1,95 positiv
positiv
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3.4 Klonierung
Man erkennt deutlich, dass keine einzelnen Banden erkennbar sind und die Kolonie PCR somit in diesem Fall fehlgeschlagen ist.
Abgebildet sind die Ergebnisse der PCR auf die Miniprep. Auch hier sieht man an den fehlenden Banden bei Verwendung der Control TAQ, dass die Klonierung nicht funktioniert hat, die PCR als solche aber sehr wohl wie man an den deutlich sichtbaren Banden bei verwendung der LA-TAQ sieht.
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4 Diskussion
4.1 GBP1 Pflanzen KO Typisierung Da sowohl Pflanzenwachstum als auch Seneszenzerscheinungen in allen 3 Pflanzereihen gleich war lassen sich leider keine Aussagen treffen. Möglicherweise treten hier die erwarteten Effekte aber auch erst in späteren Wochen auf. Die erhaltenen Ergebnisse entsprachen beim Chlorophylgehalt als auch beim Pflanzenwachstum der mit Aba besprühten Pflanzen jedoch den Erwartungen. Die Ergebnisse der zweiten Chlorophylmessung waren leider aufgrund fehlender Messungen nicht auswertbar.
4.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen Die Ergebnisse in diesem Versuch konnten die Erwartungen leider nicht erfüllen. So waren die meisten Messungen aufgrund von Fehlern nicht auswertbar obwohl die isolierten Protoplasten gut aussahen. Es wird vermutet dass bei den letzten Messungen Pippetierfehler aufgetreten sind oder Gefäße und Beschriftungen vertausc ht wurden. Dies kann aber nicht bestätigt werden.
4.3 Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen Auch dieser Versuch konnte die Erwartungen nicht erfüllen und die Theoretischen Ergebnisse nicht bestätigen. Zu einem großen Teil wird das auf die Minderwertige RNA nach Isolierung zurückzuführen sein. Hier wurden eventuell prozedurale Fehler gemacht wie z.B. ein zeitweises auftauen des Blattmaterial führte. Dies wiederum erzeugte Stress für Pflanzen und führte womöglich zu einer Ausschüttung von Nukleasen. Zudem zeigen die Ergebnisse ein Vorhandensein des GBF1 Gens in den KO Pflanzen was wiederum an den Ergebnissen zweifeln lässt, da dies
4.4 Versuch 4: Klonierung Dieser Versuch ist fehlgeschlagen. Zum einen waren die verwendeten LBSpec Platten zeitweise nicht auffindbar und zum anderen evtl auch zu alt da nicht wie erwartet einzelne Resistente Kolonien gewachsen sind sondern ein ganzer Rasen. Zudem können Fehler bei der Plasmidisolierung aufgetreten sein, was das totale Fehlen der Plasmide bei der Miniprep erklären würde-
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