Protokoll 

Spezialpraktikum Genetik 

04.05.09 – 18.05.09 

Christoph Schwörer 

 
 
 
 
 
Inhaltsverszeichnis 

Inhalt 
1. 

Einleitung ......................................................................................................................................... 3 

1.2 

1.3 

Allgemein ................................................................................................................................. 3 

Beschreibung der Versuche ..................................................................................................... 3 

1.2.1 

Versuch  1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen.......................................... 3 

1.2.2 

Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .................................................. 3 

1.2.3 

Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen ..................................................... 3 

1.2.4 

Versuch 4: Klonierung ..................................................................................................... 4 

2.  Materialien und Methoden ............................................................................................................. 5 

2.1 

Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ..................................................................... 5 

2.1.1 

Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5 

2.2 

Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen .......................................................... 5 

2.2.1 

Versuchsdurchführung .................................................................................................... 5 

2.2.2 

Verwendete Mittel .......................................................................................................... 7 

2.3 

Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ................................................................. 8 

2.3.1 

Versuchsdurchführung .................................................................................................... 8 

2.3.2 

Verwendete Materialien ................................................................................................. 9 

2.4 

Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 10 

2.4.1 

Versuchsdurchführung .................................................................................................. 10 

2.4.2 

Verwendete Materialien ............................................................................................... 10 

3 

Ergebnisse...................................................................................................................................... 12 

3.1 

3.2 

3.3 

3.4 

Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung ................................................................... 12 

Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 25 

Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 28 

Klonierung ............................................................................................................................. 34 

4 

Diskussion ...................................................................................................................................... 35 

4.1 

4.2 

4.3 

4.4 

GBP1 Pflanzen KO Typisierung .............................................................................................. 35 

Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen ........................................................ 35 

Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen ............................................................. 35 

Versuch 4: Klonierung ........................................................................................................... 35 

Seite 2 

 
 
 
 
1. Einleitung 

1.2  Allgemein 
Das  Thema  des  Spezialpraktikums  Genetik  war  die  Seneszenz  bei  Pflanzen.  Also  die 
Alterserscheinungen  wie  das  Absterben  alter  Blätter  und  das  Bilden  von  Knospen  und 
Früchten.  Gesteuert  werden  diese  Prozesse  genetisch  aber  auch  in  Abhängigkeit  von  der 
Energiebilanz  der  Pflanze.  Sie  sind  zudem  stark  abhängig  von  Umweltfaktoren  wie  Hitze, 
Wassermangel  etc.  Untersuchungen besagen,  dass  beim  einsetzen  der Seneszenz  auch der 
Spiegel  der  Radikale,  in  diesem  Fall  H2O2  stark  ansteigt.  Eine  der  Katalasen  welche  für  den 
Abbau  von  Radikalen  zuständig  ist,  ist  CAT2,  welches  durch  ein  Auftreten  von  GBF1(G-box 
binding factor 1) nach unten reguliert wird. Zudem liegen Informationen vor welche zeigen, 
dass CAT2 in älteren pflanzen stark nach unten reguliert wird. Mit den folgenden Versuchen 
soll  nun  ein  Zusammenhang  zwischen  der  Expression  von  GBF1  in  älteren  Pflanzen  und 
deren  Seneszenzerscheinungen  untersucht  werden.  Hierzu  wurden  nun  3  Pflanzereihen 
verwendet  eine  Reihe  Col0  Wildtyp  Arabidopsis  Pflanzen  und  je  eine  Reihe  Ex  und  Int 
Planzen bei denen das Gen für GBF1 jeweils im Extron oder Intron ausgeschaltet wurde. 

1.3  Beschreibung der Versuche 

1.2.1 Versuch  1: Phänotypisierung von GBF1 knock-out Pflanzen 
Dieser  Versuch  bestand  aus  2  Teilen.  Zum  einen  sollten  die  Pflanzen  in  ihrem  Wachstum 
beobachtet  und  jede  Woche  Photografiert  werden  ,  zudem  sollte  ihr  Chlorophylgehalt 
bestimmt  werden.  Zum  anderen  sollte  eine  Auswahl  der  Pflanzen  mit  Abscicinsäure 
besprüht werden welche die Wirkung von Phytohormen in Pflanzen unterdrückt und einen 
natürlichen Wachstumsinhibitor darstellt. Diese sollten dann wiederum im Vergleich zu den 
Wildtypflanzen in ihrem Wachstum beobachtet werden. 

1.2.2 Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen 
Bei  diesem  Versuch  sollten  die  Protoplasten  von  transgenen  Pcat2:GUS  Pflanzen, 
Arabidopsis  thaliana,  isoliert  werden.  Diese  Protoplasten  sollten  anschließend    zum  Einen 
mit  einem  leeren  35  S  Vektor  (PY01)  und  zum  Anderen  mit  einem  35  S:GBF  1  Vektor 
transformiert werden. Da das Reportergen GUS hinter einem CAT2 Promotor bei Zugabe von 
GBF1  reduziert  exprimiert  wird,  wurde  bei  Verwendung  des  35S  Vektors  auch  eine 
Reduktion der GUS Aktivität im Vergleich zur Verwendung des PY01 Vektors erwartet. 

1.2.3 Versuch 3: Expressionsanalysen in gbf1 KO Pflanzen 
Bei  diesem  Versuch  sollten  wöchentlich  Blattproben  der  Pflanzen  entnommen  werden  um 
daraus  RNA  zu 
isolierte  RNA  sollte  dann  aufgereinigt  und  zu  cDNA 
umgeschrieben  werden.  Mit  der  cDNA  sollte  dann  eine  RT-PCR  durchgeführt  werden.  Zur 
Kontrolle  wurden  hierbei  Actin  Primer  verwendet  und  für  den  von  GBF1  die  vorliegenden 

isolieren.  Die 

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GBF1 Primer. Erwartet wurde ein Nachweis von GBF1 in den Col0 Pflanzen in den anderen 
beiden Reihen wurde kein GBF1 erwartet. 

1.2.4 Versuch 4: Klonierung 
Bei diesem Versuch sollte das sich in einem Blueskriptvektor befindliche gbf2 Gen in einen 
cf203 GFP-Vektor kloniert werden. Dafür sollte der Vektor mit designten Primern mittels PCR 
amplifiziert und das PCR-Produkt  anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt werden. 
Um das Amplifikat aufzureinigen und den Blueskript-Vektor zu entfernen sollte dann eine 
Gelextraktion durchgeführt werden. Anschließend sollte sowohl das Amplifikat, als auch der 
cf203 GFP-Vektor einem Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI 
unterzogen und ligiert werden. Nach der darauffolgenden Transformation in kompetente E. 
coli Bakterien sollte zuerst eine Kolonien-PCR, dann eine Plasmid-Mini-Prep durchgeführt 
werden. 

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2.  Materialien und Methoden 

2.1 

Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung 

2.1.1  Versuchsdurchführung 

Die  Pflanzen  wurden  sowohl  mit  einer  Digitalkamera  als  auch  mit  einem  Flachbettscanner 
wöchentlich  aufgenommen.  Hierbei  wurde  jeweils  die  ganze  Pflanze  wie  auch  jeweils  3 
junge,  mittelalte  und  alte  Blätter  der  ersten  Rosette  gescannt.  Zudem  wurde 
Pflanzenmaterial zur späteren Verwendung eingefroren. 

Anschließend  wurde  die  Chlorophylkonzentration  der  Pflanzen  gemessen.  Hierzu  wurde 
Pflanzenmaterial  in  0,2ml  25mM  Kalium  Phosphat  Puffer  (pH  7,0),  welcher  2mM  EDTA 
enthielt  homogenisiert.  Danach  wurde  0,8  ml  Aceton  hinzugegeben  und  für  1h  bei 
Raumtemperatur stark geschüttelt. Die Lösung wurde anschließend bei 14000 u/min für 30 
min  zentrifugiert.  Der  Chlorophylgehalt  des  Überstandes  wurde  danach  im  Photometer 
gemessen. Aus der Menge an Pflanzenmaterial und der gemessenen Menge an Chlorophyll 
wurde nun die Chlorophyllkonzentration errechnet. 

Zusätzlich  wurden  über  die  komplette  Zeit  des  Praktikums  9  Pflanzen  (3  von  jeder 
Pflanzenreihe  aus  Col0  Int  und  Ex)  in  Intervallen  mit  Abscisinsäure  besprüht.  Gleichzeitig 
wurden 9 Pflanzen zur Kontrolle nicht besprüht unter gleichen Bedingungen gehalten. 

2.2  Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen 

2.2.1  Versuchsdurchführung 
Von den Verwendeten Pflanzen wurden beim ersten Versuchsdurchlauf 40 mittelgroße und 
beim 2. Durchlauf 40 große Blätter mit einer Rasierklinge in kleine (ca. 1mm) breite Streifen 
geschnitten  zusammen  mit  20  ml  Enzymlösung  auf  eine  Petrischale  gegeben.  Beim  ersten 
Versuchsdurchlauf  wurde  nun  1  Stunde  verdaut,  anschließend  Vakuuminfiltriert  und 
schließlich  2  weitere  Stunden  verdaut.  Beim  zweiten  Durchlauf  wurde  zuerst 
Vakuuminfiltriert und anschließend für 3h verdaut. Die Vakuuminfiltration lief für 20 min bei 
200 mBar. Nun wurde die Lösung mit einem 45µm Filter filtriert und die filtrierte Lösung für 
2  min  in  einem  Falcon  Tube  bei  2500  u\min  zentrifugiert.  Der  Überstand  wurde  daraufhin 
abpippetiert  und  das  verbleibende  Protoplastenpallet 
in  10ml  eiskalter  W5  Lösung 
resuspendiert. Die Lösung wurde für 30 min auf Eis gehalten und anschließend abermals für 
2 min bei 2500 u\min abzentrifugiert und in 1,5ml MMg gelöst. 

Zur PEG Transfektion wurden 200µl der gelösten Protoplasten zusammen mit 10µg DNA in 
ein Eppendorf Gefäß umpippetiert und anschließend 220µl PEG Lösung hinzugegeben. Diese 
Lösung  wurde  anschließend  bei  25°C  für  30min  inkubiert  und  danach  mit  2ml  W5  Lösung 
versetzt  um  den  Transfektionsprozess  anzuhalten.  Danach  wurde  für  2min  bei  100g  (1500 
u\min)  abzentrifugiert  und  der  Überstand  verworfen.  Die  Lösung  wurde  nun  mit  1ml  W5 

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Puffer versetzt und für 20h im Dunkeln über Nacht inkubiert. Es wurden jeweils 3 Proben mit 
dem PY01 Vektor, 3 mit dem P35S Vektor sowie eine mit dem CF 203 Vektor angefertigt. 

Die inkubierten Lösungen wurden nun für 2 Tests verwendet, ein GUS assay und eine protein 
quantifiaction. Die Vorbereitung war hierfür bei beiden Tests gleich. Die Lösung wurde mit 
10ml  fall  buffer  versetzt  und  bei  400g  für  5min  zentrifugiert,  der  Überstand  wurde 
verworfen.  Die  Protoplasten  wurden  nun  in  ein  1.5ml  Eppendorfgefäß  überführt  und 
nochmals bei 10000g für 10 sec zentrifugiert, Der Überstand wurde abermals verworfen. Die 
Protoplasten  wurden  nun  mit  36µl  protein  extraction  buffer  und  7µl  protease  inhibitor 
gelöst  und  im  Eisbad  gemörsert.  Die  Lösung  wurde  nun  bei  14000  u\min  für  10  min 
zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. 

Bei der protein quantification wurde nun 5µl Lösung mit 995µl Bradford 1:5 in einer Küvette 
versetzt und 5min ruhen gelassen. Zudem wurde ein blank mit 995µl Bradford 1:5 und 5µl 
protein  extraction  buffer  /  protease  inhibitor  Gemisch  erstellt.  Die  vorbereiteten  Küvetten 
wurden nun im Photometer bei einer Wellenlänge von 595nm gemessen. 

Zur GUS quantification wurden 2 Messreihen erstellt. Bei beiden wurde 90µl assay buffer mit 
10µl  Probe  versetzt.  Anschließend  wurde  eine  Messreihe  60  min  bei  37°C  inkubiert  und 
danach mit 900µl 0,2 M Na2CO3 versetzt um die Reaktion zu stoppen. Die andere Messreihe 
wurde nicht inkubiert. Zudem wurde wiederum ein blank mit 90 µl Assay buffer 10 µl protein 
extraction  buffer  und  900  µl  Na2CO3  erstellt.  Von  beiden  Messreihen  und  dem  blank 
wurden  nun  1µl  auf  eine  Microtiterplatte  pippetiert  und  im  Plattenphotometer  die 
Extinkiton bei 355 nm und die Emission 460 bei nm gemessen.  

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2.2.2  Verwendete Mittel 
W5 Lösung (1l): 

154 mM NaCl (8,900g) 

125mM CaCl2 (13,873g) 

5mM KCl (0,372g) 

5mM Glukose (0,990g) 

MMg Lösung (0,5l): 

Essay Buffer: 

10ml GUS puffer 

7 µl Mercaptoethanol 

4mg 4MUG (gelöst in 10 µl DMSO) 

Fall Buffer (500ml): 

0,5M Mannitol (45,5 g) 

15mM MgCl2 • 6H20 (1,524g) 

15mM MgCl2 (3,75 ml 2M NgCl2) 

0,1% MES (0,500g) 

0,5 M Mannitol (46,042g) 

pH 5,8 

autoklaviert 

0,1% MES (0,5g) 

pH 5,8 

sterile filtrate 

Extraction Buffer (10ml): 

PEG/Ca Lösung (100ml):  

50mM Tris pH 7,5 (0,5ml 1M Tris) 

40%PEG 4000 (40g) 

100mM NaCl (1ml 1M NaCl) 

0,4M Mannitol (7,285g) 

0,1% Triton X-100 (10µl Triton 100-X) 

0,1M Ca(NO3)2 • 4H2O (2,361g) 

Protease Inhibitor (7x) 

pH 8-9 mit 1-2 Tropfen KOH 

autoklaviert 

gefroren aufbewahren 

GUS Buffer (500ml): 

2,05g Na2HPO4 

1,27g NaH2PO4 

10ml 0,5M EDTA 

0,5ml Triton X-100 

0,5g N-Lauroylsarcosine Sodium Salz (=0,1%) 

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2.3 

Versuch 3 Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen 

2.3.1  Versuchsdurchführung 

RNA  Aufbereitung:  Zur  Aufarbeitung  der  RNA  wurde  folgendermaßen  vorgegangen.  Zu  Beginn  wurde 
das gefrorene Blattmaterial in, mit flüssigem Stickstoff gekühlten, Reibeschalen gemörsert und mit 1ml 
Cell-Lysis-Lösung  in  ein  2ml  Eppendorfgefäß  überführt  und  homogenisiert.  Zusätzlich  wurden  500  µl 
Protein-DNA-Precipitation  Lösung  gegeben  und  nach  10maligem  invertieren  für  10min  ins  Eisbad 
gestellt. Schließlich wurden die Proben für 10min im Kühlraum bei 14000 u\min zentrifugiert. 

1ml des Überstandes aurde nun in ein neues 2ml Eppendorfgefäß überführt, mit 1ml 100% Isopropanol 
versetzt  und  nach  mehrmaligem  invertieren  für  5min  bei  max  u\min  im  Kühlraum  zentrifugiert.  Der 
Überstand  wurde  verworfen  das  Eppendorfgefäß  auf  einem  Filterpapier  abgetupft.  Nun  wurde  der 
restliche  1ml  Überstand  der  Proben    zusammen  mit  1ml  100%  Isopropanol  in  das  bereits  verwendete 
Eppendorfgefäß  überführt  und  wiederum  für  5min  bei  max  u\min  im  Kühlraum  zentrifugiert.  Der 
Überstand wurde verworfen, das verbleibende Pellet mit 1ml 70% EtOH mehrmals invertiert und dann 
2min  bei  max  u\min  im  Kühlraum  zentrifugiert.  Das  verbleibende  EtOH  wurde  verworfen  und  das 
zurückbleibende Pellet auf dem Heizblock bei 40°C getrocknet. 

Anschließend wurde die verbleibende DNA verdaut. Um dies zu erreichen wurde das Pellet in 6 µl 10x 
Puffer  +MgCL  gelöst,  mit  4  µl  DNaseI  versetzt  und  für  30min  bei  37°C  auf  den  Heizblock  gelegt.  Nun 
wurde  1µl  EDTA  25mM  hinzugefügt  und  für  10min  bei  65°C  auf  dem  Heizblock  denaturiert. 
Abschließend  wurde  jeweils  1µl  der  Lösung  auf  dem  NanoDrop  Gerät  gemessen  um  die  RNA 
Konzentration zu bestimmen und die Proben auf Ein Gel aufgetragen um zu prüfen in welchen Proben 
die  gewünschte  RNA  zu  finden  war.  Als  positivkontrolle  und  marker  wurde  hierbei  jeweils  der  Lamda 
DNA/Hind III Marker, 2 verwendet. 

cDNA Umwandlung: Um nun die RNA in cDNA umzuwandeln wurde ein iScript Reaction Mix verwendet. 
Hierbei  wurden  4µl  5x  iScript  Reaction  Mix,  1µl  reverser  Transcriptase  und  eine  Menge  X  (wobei    X 
=1µg/RNA  Konzentration  der  entprechenden  Probe)  zusammengebracht  und  mit  autoklaviertem  auf 
20µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Proben wurden nun für jeweils 5min bei 25°C, 30min bei 42°C und 
5min bei 85°C auf dem Heizblock erhitzt. 

Semi-quantitative  RT  PCR:  zur  Amplifikation  der  cDNA  wurde  die  DNA  1:10  verdünnt.  Anschließend 
wurden  jeweils  2  Versuchsreihen  durchgeführt.  Jeweils  eine  mit  Actin  und  eine  mit  GBF1  Primern. 
Hierzu wurde jeweils ein MM (s.u.) angesetzt wobei die jeweiligen primer verwendet wurden. Wichtig 
hierbei war, um eine Gleichverteilung der DNA zu gewärhleisten, dass der MM bis auf die Primer jeweils 
für  die  Actin  und  die  GBF1  Probe  gemeinsam  angesetzt  wurde  dann  halbiert  und  mit  den 
entsprechenden  Primern  versetzt.  Die  Proben wurden dann  durch  das  PCR  Programm  laufen gelassen 
bei  60°C  Annealingtemperatur  für  30sec  und  72°C  Elongationstemperatur  für  30sec  für  insgesamt  25 
Zyklen. 

Gelelektrophorese:  Abschließend  wurde  jeweils  5µl  Probe  mit  0,5µl  Pufferlösung  versetzt  und  auf  ein 
Agarosegel aufgetragen. An dieses wurde 30min eine Spannung von 100Volt angelegt. 

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2.3.2  Verwendete Materialien 
MasterMix [MM] (10µl) 

1 µl 10xPuffer (high specific) 

0,4 µl DNTPs (10mM) 

0,1 µl Control TAQ (incl. Polymerase) 

0,5 µl verdünnte cDNA (bei Durchlauf 2 wurden 5µl verwendet) 

1 µl Primer Forward 

1 µl Primer Backward 

5,9 µl H2O (Bei Durchlauf 2 wurden 1,4 µl verwendet) 

Agarosegel: 

30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen 

1µl Ethidiumbromid (1%) 

Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml) 

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2.4 

Versuch 4: Klonierung 

2.4.1  Versuchsdurchführung 

Am  Anfang  wurde  die  vorhandene  GBF2  Sequenz  durch  eine  PCR  amplifiziert.  Hierbei  wurde  der  50µl 
Ansatz(siehe  2.4.2)  in  folgendem  PCR  Programm  eingesetzt:  2  min  bei  95°C,  30  sec  bei  95°C,  30  sec 
Annealing, 1 min Elongation bei 72°C und 7min bei 72°C. 

Die DNA wurde nun in 10µl H2O gefällt und zusammen mit 1µl loading buffer für 30 min bei 100V auf 
ein  Agarosegel  aufgetragen.  Anschließend  wurde  das  gewünschte  Fragment  mit  dem  QIAquick  Gel 
Extraction  Kit  Protokoll  aus  dem  Gel  geschnitten.  Nun  wurde  zum  einen  der  cf203  Vector  und  das 
Template in einem 100µl Ansatz für 3h bei 37°C verdaut und anschließend die Ligation des Vectors und 
des geschnittenen Templates in einem 10µl Ansatz üernacht bei 4°C durchgeführt. 

Zur  Transformation  wurden  nun  zuerst  50µl  kompetente  Zellen  und  5µl  Ligation  für  20  min  auf  Eis 
gestellt.  Um  die  Zellen  aufnahmefähig  für  Plasmide  zu  machen  wurden  sie  1  Minute  42  C  ausgesetzt 
(Hitzeschock).  Nun  wurden  250µl  LB  Medium  hinzugegeben  und  für  1h  schüttelnd  bei  37°C  inkubiert. 
Anschließend  wurde  die  gesamte  Probe  auf  einer  LBSpec  Platte  ausplattiert  und  über  Nacht  bei  37°C 
inkubiert. 

Insgesamt wurden je Platte 16 Kolonien kepickt und in je 7µl H2O in einem PCR Tube gelöst. Zusätzlich 
wurden  die  Pippettenspitzen  nach  jedem  Lösten  auf  einer  frischen  LBSpec  Platte  ausgestrichen.  Die 
gelösten Proben wurden nun zusammen mit einem Mastermix in ein PCR Gerät gegeben. 

2.4.2  Verwendete Materialien 
Agarosegel: 

30ml 1x TAE Puffer und 0,3g Agarose zusammen aufkochen 
1µl Ethidiumbromid 
Gel gießen und mit 1xTAE Puffer auffüllen.(170ml) 

50µl Ansatz: 

5µl 10X Puffer 
0,5µl LA Taq (proofreading) 
2µl Template 
2µl dNTP 
2,5µl Primer Forward 
2,5µl Primer Reverse 
35,5µl H2O 

100µl Ansatz: 

50µl Gelextrakt 
10µl 10x Tango/KpnI Puffer 
5µl KpnI 
5µl BamHI 

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30µl H20 

10µl Ansatz: 

1µl 10x Puffer 
1µl Ligase 
1µl verdauter Vektor 
7µl Gelextrakt 

Mastermix: 

0,1µl Polymerase 
1 µl 10 x Puffer 
0,4 µl dNTPs 
0,7 µl Primer Forward 
0,7 µl Primer Reverse 

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3  Ergebnisse 

3.1  Versuch 1: gbf1 knock out Pflanzen Typisierung 

Col0 4W von oben 

Col0 4W von unten 

Ex 4w von oben 

Ex 4W von unten 

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Int 4W von oben 

Int 4W von unten 

Col0 5W von oben 

Col0 5w von unten 

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Ex 5W von oben 

Ex 5W von unten 

Int 5W von oben 

Int 5W von unten 

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Col0 6W von oben 

Col0 6W von unten 

Col0 6W einzelne Blätter von oben 

Col0 6W einzelne Blätter von unten 

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Ex  6W von oben 

Ex  6W von unten 

Ex 6W einzelne Blätter von oben 

Ex 6W einzelne Blätter von unten 

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Int 6W von oben 

Int 6W von unten 

Int 6W einzelne Blätter von oben 

Int 6W einzelne Blätter von oben 

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Col0 7W von oben 

Col0 7W von unten 

Col0 7W von oben 

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Ex 7W von oben 

Ex 7W von unten 

Ex 7W einzelne Blätter von oben 

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Int 7W von oben 

Int 7W von unten 

Int 7W einzelne Blätter von oben 

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Oben Abgebildet sind die Bilder der Pflanzen  über den Wachstumzeitraum von Woche 4 bis 7. Es sind 
jeweils  2  Bilder  von  je  3  Pflanzen  der  Reichen  Col0,  Int  und  Ex.  Die  Blattmenge  und  die  Zunahme 
derBlattmenge über den betrachteten Zeitraum ist bei allen 3 Reihen gleich stark. Achtet man nun auf 
Seneszenzerscheinungen  wie  z.B.  braune  und  abgestorbene  Blätter  und  Vergleicht  die  verschiednen 
Reihen  untereinander  so  fällt  auf,  dass  alle  3  Versuchreihen  die  gleichen  Erscheinungen  in  gleichem 
Ausmaß  zeigen  oder  nicht  zeigen.  Nachfolgend  abgebildet  sind  nun  die  Ergebnisse  der  Messung  des 
Chlorophylgehaltes der einzelnen Reihen in  der 6. Woche.  

Col0 6W

Chlorophylgehalt

Gew. in g

Pflanze 1

Pflanze 2

Pflanze 3

Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt

0,01
0,06
0,08
0,01
0,06
0,1
0,04
0,01
0,07

c (mg/l)= (D x 
1000)/34,5

(0,1/Gew)*c

62,087
59,739
21,507
31,536
42,609
50,319
76,493
26,145
26,493

620,870
99,565
26,884
315,362
71,014
50,319
191,232
261,449
37,847

D652
2,142
2,061
0,742
1,088
1,47
1,736
2,639
0,902
0,914

Mittelwert:
Standartab

Jung
375,821
221,108

Mittel
144,010
102,703

Alt
38,350
11,725

INT 6W

Chlorophylgehalt

c (mg/l)= (D 

Pflanze 1

Pflanze 2

Pflanze 3

Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt

Gewicht in g
0,02
0,1
0,01
0,02
0,1
0,1
0,02
0,04
0,03

D
1,988
2,028
1,278
2,011
1,47
2,56
1,64
1,655
0,902

(0,1/Gew)*c
288,116
58,783
370,435
291,449
42,609
74,203
237,681
119,928
87,150

57,623
58,783
37,043
58,290
42,609
74,203
47,536
47,971
26,145

Jung

Mittel

Alt

Mittelwert:
Standartabw

272,415
30,127

73,773
40,781

177,262
167,417

Seite 21 

 
 
 
 
Ex 6W

Chlorophylgehalt

Pflanze 1

Pflanze 2

Pflanze 3

Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt
Jung
Mittel
Alt

Gewicht in g
0,01
0,01
0,03
0,02
0,06
0,08
0,02
0,03
0,08

c (mg/l)= (D 
x 

D

(0,1/Gew)*c

1,088
1,655
0,781
0,781
1,351
1,693
1,278
1,736

31,536
47,971
22,638
22,638
39,159
49,072
37,043
50,319

315,362
159,903
113,188
37,729
48,949
245,362
123,478
62,899

Jung

Mittel

Alt

Mittelwert:
Standartabw

179,275
93,461

158,857
142,157

90,584
60,436

Col0 6W

INT 6W

Ex 6W

700,000

600,000

500,000

400,000

300,000

200,000

100,000

0,000

Jung

Mittel

Alt

Chlorophylkonzentration nach Alter und Reihe mit Standartabweichung 

Betrachtet man den Chlorophyllgehalt und dessen Abnahme nach Alter der Blätter so lässt sich sagen, 
dass  die  Abnahme  in  der  Col0  Reihe  stärker  ausfällt.  Dies  lässt  auf  einen  funktionierenden  GBF1 
Knockout  schließen  Knockout  da  hierbei  das  Chlorophyll  in  älteren  Blättern  nicht  so  schnell  abgebaut 
wird wie in Wildtyppflanzen. 

Die 2te Chlorophyll Messung lässt sich aufgrund fehlender Gewichtsmessungen des Blattmaterials nicht 
auswerten 

Seite 22 

 
 
 
 
400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0,000

Jung

Mittel

Alt

Regressionsgerade der Chlorophylkonzentration 

Col0 6W

INT 6W

Ex 6W

Col0 6W

INT 6W

Ex 6W

Seite 23 

 
 
 
 
Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 05.05.2009 

Mit und ohne Aba besprühte Pflanzen im Vergleich vom 18.05.2009 

Man  erkennt  deutlich  die  Wachstumsinhibitorische  Wirkung  der  Abscisinsäure.  Die  behandelten 
Bplanzen  weisen  ein  deutlich  geringeres  Wachstum  auf  als  die  Unbehandelten.  Im  Vergleich  der  3 
Pflanzenreihen zeigt sich die Wirkung auf die Col0 Pflanzen am deutlichsten. 

Seite 24 

 
 
 
 
3.2  Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen 

Abbildung der Isolierten Protoplasten. Man deutlich erkennen, dass hierbei genügend funktionelle 
Protoplasten isoliert wurden. 

Ergebnisse der Bradford Messung 

Seite 25 

 
 
 
35S
577425
500170

35S
680432
563390
Ergebnisse des Gus Essay 

35S
61627
60455

Py01
616945
616249

Py02
619922
584727

Py03
612286
555998

Blank
558312

Zur Berechnung der spezifischen GUS Aktivität wurde folgende Formel verwendet: 

AGUS (nmol/mg x min) = (KMU (nM) x VKü (ml) x VF x UF (1l/1000ml)) / (PM (mg) x t (min) 

Wobei: 

AGUS   
KMU 
VKü 
VF 
UF 
PM 
T  

spezifische GUS-Aktivität 
gemessene MU Konzentration 
Volumen in Küvette 
Verdünnungsfaktor 
Umrechnungsfaktor 
Proteinmenge im Ansatz 
Reaktionszeit   

nmol/(mg x min) 
nM 

ml 

1l / 1000ml 
mg 

min 

Welche mit eingesetzten Werten zu folgendem Ergebnis führt: 

35 S
35 S
35 S

PYO1
PYO1
PYO1

KMU
77255
117042
11717

696
35195
56288

V KÜ VF
0,2 100
0,2 100
0,2 100

UF

PM
0,001 0,29814
0,001 0,28109
0,001 0,35108

0,2 100
0,2 100
0,2 100

0,001 0,24083
0,001 0,29908
0,001 0,17595

T
60
60
60

60
60
60

AGUS
86,37441
138,7954
11,12472

0,9633351
39,225848
106,63636

Mittelwert 

35 S
PYO1

78,764845
48,941846

Standard
abweichung
52,398346
43,684454

Seite 26 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i

)
n
m
*
g
m
(
/
l
o
m

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

PYO1

35 S

Die Annahme, dass das, hinter einen CAT2 Promoter geschaltete, Reportergen GUS bei Zugabe von GBF1 
redzuiert  exprimiert  wird,  konnte  mit  den  vorliegenden  Ergebnissen  leider  nicht  bestätigt  werden.  In 
den  hier  abgebildeten  Ergebnissen  ist  sogar  gegenteiliges  der  Fall.  Hier  wurde  GUS  bei  denjenigen 
Protoplasten  die  einen  leeren  Vektor  ohne  GFB1  Gen  enthielten  weniger  stark  exprimiert  als  bei 
denjenigen mit vorhandenem GBF1 Gen. 

Seite 27 

 
 
 
3.3  Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen 

Seite 28 

 
 
 
Seite 29 

 
 
 
 
Seite 30 

 
 
 
  
Seite 31 

 
 
 
 
Oben abgebildet sind alle im Verlauf des Versuchs produzierten Gelbilder. Die mit „RNA“ beschrifteten 
Bilder sind jeweils die Kontrollen zum prüfen ob verwendbare RNA vorhanden war. Die mit X markierten 
Proben wurden hierbei jeweils für verwendbar befunden zur Umwandlung in cDNA weiter verendet. In 
manchen  Fällen  erkennt  man  hierbei  die  zwei  obersten  Banden  welche  die  vorhandene  18S  und  25S 
RNA  darstellen.  Die  immer  sichbaren  starken  dunklen  Banden  ganz  unten  bilden  jeweils  die  defekte 
degradierte  RNA.  Die  mit  cDNA  markierten  Bilder  sind  die  jeweils  nach  der  RT  PCR  aufgetragenen 
Proben. Die verwendeten Primer sind hierbei auf dem Bild vermerkt. Die untersten Banden stellen auf 
diesen Bildern die komplementären Primer dar die sich aneinander gelagert haben und keine Expression 
darstellen. Falls darüber eine zweite Bande zu sehen ist so stellt dies eine jeweilige positive Expression 
der dem Primer entsprechenden cDNA dar. Einzig der Fall der verwendeten Probe „Col 5C“ auf Bild B5 
stellt sich als unerklärbar dar da hier eine GBF1 Bande aber keine Actin Bande zu sehen ist, welche aber 
zu sehen sein sollte. Das Ergebnis wird daher nicht als positiv bewertet. Die einzige positive Bewertung 
für eine GBF1 Expression stellt die Probe Int 8W von Bild B9 dar, da hier eine Actin Expression sowie eine 
sehr geringe GBF1 Expression zu sehen ist. Dies dürfte aber aufgrund des Knockouts in den Int Pflanzen 
nicht der Fall sein. 

Seite 32 

 
 
 
 
 
Eine Zusammenstellung der Auswertung der Bilder und der gemessenen RNA-Konzentration und 
Reinheit findet sich in folgender Tabelle: 

Probe

RNA Isoliert

RNA 
Konzentration

Reinheit 
(260/280)

Actin

GBF1

Col0 4W
Col0 5W
Col0 6W
Col0 7W

Int 4W
Int 5W
Int 6W
Int 7W
Int 8Wa
Int 8Wb

Ex 4W
Ex 5W
Ex 6W
Ex 7W

positiv

0,256

n.v.

positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv

positiv
positiv
positiv
positiv

0,66
873,2
0,066
0,66
210,4
122,7

0,66
0,07
230,4
0,91

n.v.
2,1 positiv

n.v. positiv
1,76 positiv
1,94

n.v. positiv
2,01

2,1 positiv
1,95 positiv

positiv

Seite 33 

 
 
 
 
3.4  Klonierung 

Man erkennt deutlich, dass keine einzelnen Banden erkennbar sind und die Kolonie PCR somit in diesem 
Fall fehlgeschlagen ist. 

Abgebildet sind die Ergebnisse der PCR auf die Miniprep. Auch hier sieht man an den fehlenden Banden 
bei Verwendung der Control TAQ, dass die Klonierung nicht funktioniert hat, die PCR als solche aber sehr 
wohl wie man an den deutlich sichtbaren Banden bei verwendung der LA-TAQ sieht. 

Seite 34 

 
 
 
 
 
 
 
 
4  Diskussion 

4.1  GBP1 Pflanzen KO Typisierung 
Da  sowohl  Pflanzenwachstum  als  auch  Seneszenzerscheinungen  in  allen  3  Pflanzereihen  gleich  war 
lassen sich leider keine Aussagen treffen. Möglicherweise treten hier die erwarteten Effekte aber auch 
erst  in  späteren  Wochen  auf.  Die  erhaltenen  Ergebnisse  entsprachen  beim  Chlorophylgehalt  als  auch 
beim Pflanzenwachstum der mit Aba besprühten Pflanzen jedoch den Erwartungen. Die Ergebnisse der 
zweiten Chlorophylmessung waren leider aufgrund fehlender Messungen nicht auswertbar.  

4.2  Versuch 2: Promotor CAT2: GUS Reportergenanalysen 
Die Ergebnisse in diesem Versuch konnten die Erwartungen leider nicht erfüllen. So waren die meisten 
Messungen aufgrund von Fehlern nicht auswertbar obwohl die isolierten Protoplasten gut aussahen. Es 
wird  vermutet  dass  bei  den  letzten  Messungen  Pippetierfehler  aufgetreten  sind  oder  Gefäße  und 
Beschriftungen vertausc ht wurden. Dies kann aber nicht bestätigt werden. 

4.3  Versuch 3: Expressionsanalyse in gbf1 KO Pflanzen 
Auch dieser Versuch konnte die Erwartungen nicht erfüllen und die Theoretischen Ergebnisse nicht bestätigen. Zu 
einem  großen  Teil  wird  das  auf  die  Minderwertige  RNA  nach  Isolierung  zurückzuführen  sein.  Hier  wurden 
eventuell  prozedurale  Fehler  gemacht wie  z.B.  ein  zeitweises  auftauen  des  Blattmaterial  führte. Dies  wiederum 
erzeugte  Stress  für  Pflanzen  und  führte  womöglich  zu  einer  Ausschüttung  von  Nukleasen.  Zudem  zeigen  die 
Ergebnisse  ein  Vorhandensein  des  GBF1  Gens  in  den  KO  Pflanzen  was  wiederum  an  den  Ergebnissen  zweifeln 
lässt, da dies  

4.4  Versuch 4: Klonierung 
Dieser  Versuch  ist  fehlgeschlagen.  Zum  einen  waren  die  verwendeten  LBSpec  Platten  zeitweise  nicht 
auffindbar  und  zum  anderen  evtl  auch  zu  alt  da  nicht  wie  erwartet  einzelne  Resistente  Kolonien 
gewachsen sind sondern ein ganzer Rasen. Zudem können Fehler bei der Plasmidisolierung aufgetreten 
sein, was das totale Fehlen der Plasmide bei der Miniprep erklären würde- 

Seite 35 

 
 
 
